应用案例(便携式4通道SPR仪-P4SPR):了解影响SPR生物芯片的因素,优化蛋白质-蛋白质互作的测定

了解影响SPR生物芯片的因素,优化蛋白质-蛋白质互作的测定

Understanding the factors affecting sensing efficiency in SPR biosensing

Assay optimization of protein-protein interaction

翻译整理:北京佰司特贸易有限责任公司

背景介绍

急性淋巴细胞性白血病(ALL)是当源自骨髓的未成熟白细胞变成癌性细胞,诱导血流增殖,而导致器官增殖,进而阻止其他血细胞的正常功能的一种疾病。证明其对ALL有效的主要生物治疗剂之一是大肠杆菌L-天冬酰胺酶(EcAII)。  进行此类治疗的挑战在于患者会产生和EcAII的抗体并因此降低治疗效率而潜在地使生物化学治疗剂失效。

为了检测患者是否有产生对EcAII的抗体,EcAII曾经在免疫测定形式使用。该方法先前已配置P4SPR用于检测儿童患者未稀释过的血清中的抗治疗抗体,EcAII抗体。  使用SPR进行生物传感的优势在于减少样品制备和缩短分析时间。然而,开发该测定法的主要挑战是在于固定天然EcAII抗原的因素确保传感器效率的重复性。 
SPR是一种强大的生物分析技术,在测定优化中可以实时和无标记监测。在此仔细监测固定密度和EcAII抗体的传感反应。这使研究人员能够了解固定过程的基础机制并确定最佳方法, 可以为临床相关的免疫测定建立更有效的传感器。

天然EcAII的固定方法挑战

图1 –固定方法的比较以及由此产生的感应效率和灵敏度。

在SPR分析方法开发中,固定方法在确保最佳和可重复的传感效率中起着至关重要的作用。如果固定的受体具有受阻的结合位点,则固定化学可能会影响抗体识别的效果(图1)。这对SPR传感或任何其他免疫测定构成挑战,其中灵敏度取决于最佳的蛋白质-蛋白质结合相互作用。在固定过程中影响测定性能的另一个关键挑战是维持四级结构。固定后对四级结构的更改可能会影响SPR信号并产生不正确的信息。表面和四级结构上的蛋白质密度都可用于构建EcAII免疫传感器。

图2 –天然和带有His-tag的EcAII结构。 (A)与L-天冬氨酸络合的EcAII作为功能同四聚体(左)和单个单体亚基(右)。 N末端和C末端用于金属配位,表面暴露的赖氨酸残基用于共价交联。(B)显示为带状结构的二聚体(左)和构象表位(橙色表面)聚集在活性部位的入口周围。 (C)EcAII,N21-EcAII和N26-EcAII的天然和变体具有N端His-tags,单体和四聚体C8-EcAII具有C端His-tag。

 

EcAII是由同型二聚体二聚形成功能性同型四聚体。 同源四聚体结构表现出通过同源二聚体的互补形成的四个相同的活性位点。尽管已经鉴定了EcAII的几种抗原决定簇,但其固定化形式的抗原性仍然未知。

为了更好地理解这些因素对患者对EcAII免疫原性的影响,将天然EcAII的异质表面固定与同质EcAII进行了比较。 EcAII的表面固定是通过协调EcAII变体(四聚体和单体)的N或C端组氨酸(His)标签进行的(图1)。

  • EcAII抗体固定

首先,在SPR金传感器上涂上AffiCoat(一种肽自组装单层(SAM)),以减少非特异性结合并引入–COOH基团。末端-COOH可通过与EDC / NHS偶联的胺与天然EcAII上的赖氨酸残基共价结合。为了末端His-tag的金属螯合,将Co-NTA进一步连接到AffiCoat上。在两种表面处理下,EcAII与表面接触20分钟,然后用缓冲液洗去。

天然大肠杆菌L-天冬酰胺酶II可通过Kidrolase,EUSA Pharma商购获得。在内部完成了为固定化和SPR传感而开发的重组EcAII的N和C端His标签版本的设计和生产。测试了EcAII的三个带有His标签的版本:N21和N26-EcAII包含20和25个其他氨基酸,C8-EcAII包含8个其他氨基酸(图2)。

免疫传感器SPR性能

此实验使用台式P4SPR设备进行SPR生物检测。首先,将准备好的天然和重组EcAII免疫传感器钝化,以减少随后的测试中的非特异性结合。注入空白的人血清并与传感器接触10分钟。然后,注入掺有2种浓度的多克隆兔抗天冬酰胺酶抗体的人血清,并监测结合20分钟。

固定化表征和免疫传感器性能
 

3 – EcAII变体的固定化。注射40μg蛋白(0.1 mg mL-1)的Kidrolase(黑色)或带有His标记的EcAIIN21-EcAII(绿色),N26-EcAII(蓝色),和C8-EcAII(红色)。确定了单体变体。

 

1 – EcAII受体的固定化和免疫传感性能摘要。

 

表1总结了各种EcAII变体在SPR芯片上的固定特性及其生物分析性能。表面密度的计算见附录。

首先将天然EcAII和其他变体固定在SPR传感器芯片上,以评估固定方式对受体表面覆盖的影响(图3)。通过EDC / NHS化学方法将赖氨酸残基共价交联,将天然EcAII以无规方式固定在传感表面上,而将带有His标记的EcAII变体以金属配位固定在传感器表面上。确定定向的表面覆盖率。带His标签的EcAII比共价交联的EcAII大5至10倍以上(表1)。此外,His标记的EcAII的表面覆盖率可高度再现,相对标准偏差(%RSD)为3%至18%,而天然EcAII为50%至70%。与N端变体相比,C8-EcAII(单体或四聚体)的表面覆盖率低的原因可能是C端标签(8个残基)难以配位。此外,结果表明单体C8-EcAII不会重新组装成四聚体形式,而四聚体EcAII变体在固定后并未发生结构变化,如相应的免疫传感器SPR响应,单体形式的低SPR位移和高SPR位移所证明的那样四聚体形式(图1.)。

此外,P4SPR数据显示,与Kidrolase和C8-EcAII相比,N末端修饰的带有His标记的EcAII具有更高的表面密度,从而可以更好地检测到抗EcAII的检测结果,如15和150 µg / mL所示。与随机定向的天然EcAII相比,N26-EcAII和C8-EcAII的SPR检测增加了2倍。定向四聚体N-和C-末端标记的EcAII进一步增强了信号,分别比Kidrolase和定向单体C8-EcAII提供了5倍和3倍的检测信号(表1)。关于传感的再现性,在两种目标抗体浓度下,Kidrolase的RSD的35%也高于His-tagged变体的RSD的5%至20%(表1)。在较高的抗体浓度和定向的N末端带有His标记的变体中,R2为0.9571时,EcAII受体的免疫感应信号与表面覆盖之间存在相关性(图4)。
 

4 抗体对固定受体结合的效率,报告为每个EcAII分子(抗原; Ag)与Kidrolase(黑色),N21-EcAII(绿色),N26-EcAII(蓝色)结合的抗体分子(Ab)的数量,以及C8-EcAII(红色)。数据以平均值表示,误差线表示标准偏差。

 

感应效率

感测效率定义为每个固定受体分子或Ab / Ag结合比检测到的分析物分子数量。据观察,尽管四聚体EcAII具有低表面密度和较差的敏感性,但其具有比His标记变体明显更好的感测效率。每个固定的Kidrolase分子平均检测到2.3个靶抗体分子,结合比率为1:2。这比四聚组His标记的EcAII变体的效率高2-3倍,后者每个分子只能结合0.9抗体。这是因为传感表面的密度比Kidrolase高(表1)。固定化Kidrolase的平均密度比天然EcAII低约7倍(1.6 x 10 11分子cm -2),在晶格(PDB 3ECA)平面中的平均表面密度约为1.15 x 10 12分子cm -2。与固定的四聚体之间的平均c.t.c距离相比,固定中心四聚体之间的平均c.t.c距离要大2.7倍(30.5 nm),与中心之间的c.t.c平均距离为11.4 nm。相反,固定在传感表面上的四聚体His标签EcAII变体的表面密度比晶格大1.3至1.8倍,四聚体之间的c.t.c距离短约1.2至1.3倍。这可能是由于8位和25位残基的末端连接的四聚体具有较高的堆积度,从而有利于二价抗体结合。但是,His标记的EcAII较低的感测效率可以通过较高的表面密度和可重复性来补偿,这最终可确保在检测血清中的抗EcAII时具有更高的灵敏度。

P4SPR优势

Affinité仪器的P4SPR是模块化,便携式,多通道系统,在测定开发和优化方面具有灵活性。它的可访问性和易用性允许快速评估测定参数,例如固定方法对受体表面覆盖率的影响以及传感效率。它的多通道功能提高了结果精度,此外,已证明的测定灵敏度证明该系统是用于免疫传感的强大分析工具,这对于分析生物样品中的生物治疗剂特别有用。与常规ELISA技术相比,无需进行样品预处理以及最少且较短的测试程序是其主要优势之一。
 

P4SPR与ELISA相比的优势

-无标签

-使用最少的试剂

-更少的准备步骤

公司简介

Affinité Instruments成立于2015 年,是一个从蒙特利尔大学衍生的企业。Affinité nstruments的创始人在SPR 领域积累了十多年丰富的研究结果的知识,并通过多元化的商业、科学和工程领域经验将创新的SPR 技术商业化。

附件-固定式EcAII的表面覆盖

固定化的天然或带有His标签的EcAII的表面覆盖率(Γ,ng cm-2)使用以下公式由固定化EcAII时的波长变化(ΔλSPR)计算得出:

其中ρ是吸附的蛋白质单层的密度(1.3 g cm-3),ld是等离激元穿透距离(〜230 nm),Δλ是与蛋白质固定相关的波长偏移,m是SPR传感器(1765 nm / RIU),nSAM是肽SAM的折射率(1.57 RIU),nmedium是缓冲液的折射率(1.33476 RIU)。使用公式Q =ΓS确定固定在传感表面(Q)上的EcAII总量,其中S = 0.166 cm2与蛋白质接触。

参考文献
1. Swain, A. L.; Jaskolski, M.; Housset, D.; Rao, J. K. M.; Wlodawer, A. Crystal structure of Escherichia coli L-asparaginase, an enzyme used in cancer therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993, 90, 1474−1478.

2. Shinnick, S. E.; Browning, M. L.; Koontz, S. E. Managing
hypersensitivity to asparaginase in pediatrics, adolescents, and young adults. J. Pediatr. Oncol. Nurs. 2013, 30, 63−77.

3 Aubé, A.; Charbonneau, D. M.; Pelletier, J. N.; Masson, J.-F. Response Monitoring of Acute Lymphoblastic Leukemia Patients Undergoing l-Asparaginase Therapy: Successes and Challenges Associated with Clinical Sample Analysis in Plasmonic Sensing. ACS Sens. 2016, 1, 1358−1365.

4. Epp, O.; Steigemann, W.; Formanek, H.; Huber, R. Crystallographic evidence for the tetrameric subunit structure of L-asparaginase from Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 1971, 20, 432−437.
 

Affinité的P4SPR设备的简单、低成本且易于操作等特点降低了SPR应用的难度,紧凑的P4SPR,其外形尺寸与一个A4书本相当,可以在实验室工作台上很容易地设置,并在几分钟的培训中由任何人 (从本科生到宇航员,高级化学家到周末科学家)操作。P4SPR 的坚固设计提供了从几分钟到几个小时的独特的灵活测定时间,以适应广泛的生物分子相互作用动力学。便携式4通道SPR仪-P4SPR是基于SPR原理,可实现实时无标记检测相互作用,不仅可以满足传统的大型SPR设备的参数要求,还可以用于户外现场中的农药残留、微量药物、污染物、爆炸物等环境试验。可以用于验证结合、亲和力测定、动力学测定、浓度测量;适用于小分子化合物(<100Da的小分子)、核酸、多肽、蛋白、脂类、多糖、纳米颗粒、病毒、微生物、细胞等各种样品;可检测各种复杂样品,如血液、牛奶等;4通道同时检测,实时扣除背景,自动做重复,获得可信数据;10分钟验证是否结合,并且获得亲和力和结合/解离速率;可手动进样,操作简单,无需专人操作和维护;可与其它仪器(HPLC,MS等)联合使用。


主要参数:

※ 基于SPR原理,实时无标记检测相互作用

※ 可以用于验证结合、亲和力测定、动力学测定、浓度测量

※ 适用于小分子化合物、核酸、多肽、蛋白、脂类、多糖、纳米颗粒、病毒、微生物、细胞等各种样品

※ 可检测各种复杂样品,如血液、牛奶等

※ 4通道同时检测,实时扣除背景,自动做重复,获得可信数据

※ 10分钟验证是否结合,并且获得亲和力和结合/解离速率

※ 可手动进样,操作简单,无需专人操作和维护

※ 可与其它仪器(HPLC,MS等)联合使用

※ 仪器小巧,易于携带,可在用于各种户外环境中的现场检测

※ 价格合适,单个实验室即可负担,方便日常使用

 

北京佰司特贸易有限责任公司 (https://www.best-sciences.com):

类器官培养仪-HUMIMIC;灌流式细胞代谢分析仪-IMOLA;便携式4通道SPR仪-P4SPR;蓝光/绿光LED凝胶成像;Nanocellect细胞分选仪-WOLF;微纳加工点印仪-NLP2000/DPN5000;

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创建时间:2020-12-31 17:00