Wenhua Kuang， Zhenhua Tian， Gan Zhang， Fan Wu， Jinyue Li， Jingjing Tang， Huanyu Zhang， Xinyue Zhuo， Zhihong Hu， Manli Wang， Haiyan Zhao， Zengqin Deng

中国科学院武汉病毒研究所，病毒学与生物安全国家重点实验室，湖北省武汉市，邮编430207

中国科学院大学，北京，邮编 100049

武汉大学生命科学学院，病毒学与生物安全国家重点实验室，湖北省武汉市，邮编 430072

中国科学院水生生物研究所，水产生物技术与养殖生态学国家重点实验室，湖北省武汉市，邮编430072

湖北大学生命科学学院，湖北省武汉市，邮编 430062

湖北江夏实验室，湖北省武汉市，邮编 430207

通信作者：邓增钦，电子邮箱：dengzengqin@wh.iov.cn 也可致信赵海燕，电子邮箱：hy.zhao@whu.edu.cn

也可将信件寄给王曼丽。电子邮箱：wangml@wh.iov.cn

前两位作者应被视为共同第一作者。

摘要

尼罗病毒包括几种人类病原体，如克里米亚 - 刚果出血热病毒（CCHFV）和卡索克罗病毒（KASV）。病毒聚合酶的夺帽内切核酸酶（EN）结构域对于转录至关重要，是很有前景的抗病毒靶点。然而，尼罗病毒 EN 的结构和功能机制仍知之甚少。在此，我们介绍了 CCHFV 和 KASV EN 的生化和结构研究。生化实验表明，这两种 EN 的 RNA 内切核酸酶活性可被锰离子激活，并且对富含尿嘧啶的 RNA 底物表现出偏好。这种活性可被三种金属螯合抑制剂（DPBA、L-742，001 和 BXA）抑制，其中 BXA 显示出最高的结合亲和力和抑制效力。我们还确定了 CCHFV 和 KASV EN 在无配体、金属离子结合和抑制剂结合状态下的九个晶体结构。比较结构分析揭示了尼罗病毒 EN 独有的双金属离子结合模式，其中保守残基通过桥接水分子协调两个锰离子。在 KASV EN 与抑制剂结合的结构中，BXA 与酶形成了额外的稳定作用力，这解释了其更强的抑制效果。功能测定进一步证实，双金属离子机制对于病毒转录至关重要。这些发现为针对克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）及相关病原体的抗病毒药物的合理设计提供了结构基础。

尼罗病毒是一大类由蜱传播的布尼亚病毒，其中包括几种感染人类和动物的高度致病性病原体。其中，克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）是最重要的致人类病原体。CCHFV 在亚洲、欧洲和非洲的 30 多个国家流行。感染 CCHFV 可导致急性发热、出血症状和多器官衰竭等严重疾病，病死率高达 40%。由于其高致病性以及缺乏获批的疫苗和抗病毒药物，CCHFV 被列为生物安全四级（BSL-4）病原体，并被世界卫生组织（WHO）列为需要紧急研究以开发应对措施的优先病原体。感染尼罗病毒的其他成员，如卡索克罗病毒（KASV）、杜格贝病毒（DUGV）和埃尔韦病毒，也会在人类中引起症状，包括头痛、皮疹、腹泻、血小板减少和神经系统疾病。在牲畜中，内罗毕绵羊病病毒（NSDV）感染会导致出血性胃肠炎。近年来，越来越多的新兴尼罗病毒被发现，这引发了人们对它们可能给公共卫生带来生物安全风险的担忧。

分段负链 RNA 病毒（sNSVs），包括布尼亚病毒和正粘病毒，采用夺帽机制来启动其病毒基因组的转录。这一过程由 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RdRP；在布尼亚病毒中也称为 L 蛋白）的 N 端内切核酸酶（EN）结构域介导，该结构域切割宿主来源的带帽 RNA 片段，作为病毒 mRNA 合成的引物。夺帽 EN 结构域是一种金属离子依赖性核酸内切酶，其特征在于保守的 PD...D/ExK 催化基序。结构和生化研究根据其活性位点结构和酶活性将病毒 EN 分为两类，即 His+ EN 和 His−EN。His+ EN 存在于披膜病毒科、裂谷热病毒科和汉坦病毒科以及流感病毒中，其含有一个保守的组氨酸，用于配位第一个金属离子，同时活性位点环中还存在一个酸性残基，用于结合第二个金属离子。这些酶在体外表现出强大的内切核酸酶活性。相比之下，仅存在于沙粒病毒科的 His−ENs 用谷氨酸或天冬氨酸替代组氨酸来协调金属离子，并且具有一个不参与金属离子协调的远端灵活环。值得注意的是，在体外实验中，His−ENs 几乎没有酶活性。

与 His+ ENs 和 His−ENs 相比，尼罗病毒的 ENs 展现出一种混合的活性位点基序，融合了两类的关键特征。具体而言，它们保留了 His−ENs 的一个保守谷氨酸残基，这是负责第一个金属离子配位的标志，同时具有 His+ ENs 的特征性灵活环区，该环区可能参与第二个金属离子的结合。除了这些混合特征外，尼罗病毒的 ENs 在结构域位置和整体组成方面也与其他布尼亚病毒的 ENs 存在差异（图 1A）。大多数布尼亚病毒的 ENs 位于聚合酶的 N 端，约含 200 个残基，而尼罗病毒的 ENs 则位于 N 端下游约 500 至 900 个残基处，跨度约为 350 个残基。此外，尼罗病毒的 ENs 包含一个或两个独特的插入片段（30 至 40 个残基，插入 1 和 2），据预测会形成其他病毒 ENs 中所没有的高度灵活的环区。对布尼亚病毒的系统发育分析进一步突显了尼罗病毒 ENs 的独特性。来自五个感染人类的布尼亚病毒科的代表性 ENs 聚集为三个主要分支（图 1B 和补充表 S1）。一个分支包括披 Bunyaviridae、Phenuiviridae 和 Hantaviridae，与已知的 His+ 内切核酸酶（EN）一致。另一个分支由 Arenaviridae 组成，对应于 His−EN。值得注意的是，尼罗病毒 EN 形成一个单独的分支，表明其与这些典型群存在进化上的差异。总体而言，这些显著的区别表明尼罗病毒 EN 可能代表了一组具有不同酶学和结构特征的病毒内切核酸酶。然而，尼罗病毒 EN 的金属离子依赖性催化机制仍未解决，这主要是由于缺乏高分辨率的结构信息以及对这些 EN 的生化特性研究有限。

夺帽内切核酸酶是短负链RNA病毒普遍具有的特征，在病毒转录过程中发挥着关键作用，因此成为抗病毒药物研发的理想靶点。鉴于内切核酸酶（ENs）的金属离子依赖性活性，人们探索了大量金属螯合抑制剂来靶向内切核酸酶。二酮酸化合物是首个用于靶向流感病毒内切核酸酶的抑制剂类别。其中，2，4-二氧代-4-苯基丁酸（DPBA）作为二酮酸化合物的原型，对流感病毒内切核酸酶的抑制作用半数最大抑制浓度 (IC₅₀) 为数十微摩尔水平。随后，DPBA 的衍生物 L-742，001 出现，其抑制内切核酸酶活性和细胞内病毒复制的能力更强，在亚微摩尔浓度下即可发挥显著作用。最近，巴洛沙韦酸（BXA）作为一种高效抑制剂崭露头角，在体外表现出纳摩尔级的抗病毒活性，并在流感病毒的小鼠模型中显示出治疗效果。其前药巴洛沙韦玛波瑞（baloxavir marboxil）已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准，成为首个临床可用的针对内切核酸酶的流感治疗药物。值得注意的是，DPBA、L-742，001 和 BXA 在酶促和细胞基质检测中也对多种布尼亚病毒表现出不同程度的抑制作用，这突显了它们作为广谱抗病毒药物的潜力，因为它们具有保守的金属螯合药效团。与它们对流感病毒的抑制效力相比，这些抑制剂对布尼亚病毒的抑制效果欠佳，IC50 值在几微摩尔到几百微摩尔之间，这表明需要进一步优化。然而，这些抑制剂作用的详细分子机制尚不清楚，这给针对布尼亚病毒的合理药物优化和进一步抗病毒药物开发带来了挑战。

目前，我们对尼罗病毒核酸内切酶（EN）的结构和功能的理解存在不足，这对于全面阐明病毒 EN 的催化机制以及开发针对克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）及相关尼罗病毒的有效抗病毒策略至关重要。在本研究中，我们展示了 CCHFV EN 的无配体晶体结构以及一系列高分辨率的 KASV EN 的无配体形式、Mn2+ 结合形式以及与三种代表性 EN 抑制剂的复合物晶体结构。我们对尼罗病毒 EN 的金属离子依赖性内切酶活性进行了生化表征，研究了 EN 催化过程中保守活性位点残基的功能作用，并评估了抑制剂的结合亲和力和抑制活性。我们的研究结果揭示了尼罗病毒科特有的双金属离子结合模式，这对于实现其全部催化活性至关重要。此外，我们发现经美国食品药品监督管理局批准的抑制剂 BXA 对尼罗病毒内切核酸酶表现出强大的抑制活性，并且与卡塞卢病毒内切核酸酶的活性位点口袋的相互作用比另外两种抑制剂（DPBA 和 L-742，001）更为广泛。我们综合的生化、结构和功能分析为尼罗病毒内切核酸酶的催化和抑制机制提供了重要见解，为基于结构的药物设计和优化提供了潜在机会。

材料与方法

KASV 和 CCHFV 包膜糖蛋白的总体结构

KASV EN 的无金属离子和 Mn2+ 结合结构分别在 P2-1 空间群中以 1.90 A˚ 和 1.98 A˚ 的分辨率解析成功。除了 726–779 位残基（与插入片段 1 对应，预测为高度灵活的环）外，整个蛋白质的电子密度清晰可见。CCHFV EN 的无金属离子结构在 P2-1-2-1-2-1 空间群中以 3.05 A˚ 的分辨率解析成功，存在两个无序区域，分别对应插入片段 1（703–729 位残基）和插入片段 2（764–795 位残基）。由于复合晶体的衍射质量不佳，未能获得 CCHFV EN 的 Mn2+ 结合结构。因此，我们重点对高质量的 KASV EN 结构进行详细分析。
与先前报道的 EN 结构类似，KASV EN 采用双叶结构。其中一叶包含 N 端的四螺旋束（α1–α3 和 α9），另一叶由一个中央五链β折叠片夹在五条螺旋之间构成，其中螺旋α4–α6 和α8 部分覆盖β折叠片，而螺旋α7 位于β折叠片底部（图 3A）。活性位点位于两叶之间，包含两个由高度保守的酸性残基配位的锰离子（补充图 S4C）。连接α3 和α4 的灵活环（图 3A 中以绿色突出显示，标记为 LoopE）带有一个保守的酸性残基，参与锰离子结合，其功能与 His+ ENs 中观察到的类似。CCHFV EN 与 KASV EN 的整体构象高度一致，除位于β3 两端的两条小螺旋外，所有可叠加的α碳原子的均方根偏差（RMSD）值为 1.2 Å（图 3 和补充图 S4A）。

结构比较表明，KASV EN 与来自其他布尼亚病毒和流感病毒的 EN 具有相似的整体结构（均方根偏差为 2.7 - 3.5 埃，残基覆盖率为 42% - 63%）（图 3A 和 B），尽管它们的序列同源性非常低（一致性在 11% - 17% 之间，相似性在 16% - 24% 之间），这表明病毒夺帽内切酶的结构域组织具有保守性。然而，KASV 和 CCHFV 的 EN 与其他病毒的 EN 相比具有独特的结构特征，包括α7 螺旋和一个或两个无序插入（插入 1 和插入 2），这些特征仅存在于尼罗病毒的 EN 中（图 3B）。两个结构中的α7 螺旋环绕着中央β折叠片的底部，为整体结构模块提供稳定支撑，并部分封闭了活性位点口袋的底部。插入 1 位于β1 和β2 之间，靠近活性位点，相对保守，几乎存在于所有尼罗病毒中。相比之下，插入 2 位于α7 之后，并连接到最外侧的β3，远离活性位点。这种插入片段在长度和序列上差异很大，在克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）和几种其他纳伊罗病毒（如 NSDV 和 DUGV）中尤其长（补充图 S4C）。这些纳伊罗病毒 EN 中的独特结构元件可能共同发挥特定的功能作用，例如调节 EN 活性、促进底物结合或与病毒聚合酶的其他功能域建立相互作用。

KASV EN 的活性位点展现出一种独特的金属离子结合模式

apo KASV EN 结构的活性位点中未发现金属离子，而在 MnCl₂-soaked 晶体中观察到了两个金属离子的明显电子密度。在与 Mn2+ 结合的结构中，活性位点具有保守的 E668...E 682...P 718D719...E 831...K 841 催化基序，可结合两个锰离子（图 4A）。Mn1 由 D719 的侧链、V832 的羰基、两个离散水分子（W2 和 W4）以及两个桥接水分子（W1 和 W3）八面体配位，W1 和 W3 与 E668 和 E831 的侧链形成氢键。同样，Mn2 主要通过溶剂介导的配位环境与蛋白质结合，D719 是其唯一的直接蛋白质配体。这种配位涉及一个离散水分子（W4）以及三个桥接水分子（W5、W6 和 W7），它们分别与 E831、E682 和 E668 的侧链相互作用。此外，假定的催化残基 K841 和与金属离子配位相关的 K848 通过桥接水分子（W3 和 W8）相互作用（图 4A）。比较无金属离子结合的（apo）结构和 Mn2+ 结合的结构发现，除了 LoopE 中的 E682 侧链重新定位至 Mn2+ 结合位点外（补充图 S6A），活性位点残基在金属离子结合时发生了细微的构象变化。CCHFV 和 KASV 的 EN 无金属离子结合结构的活性位点构象几乎相同（补充图 S4B）。序列比对分析进一步表明，金属离子配位残基在尼罗病毒 EN 中是严格保守的（补充图 S4C），这表明尼罗病毒 EN 具有共同的金属离子结合构型。

与先前报道的 Mn²+-boundHis+ ENs 和 His−ENs 结构相比，KASV EN 的活性位点残基构型相似。然而，其金属离子结合模式与这两类酶截然不同（图 4A）。首先，KASV EN 中的 E668（相当于 His+ ENs 中的 His 和 His−ENs 中的 Glu/Asp）通过桥接水分子同时参与 Mn1 和 Mn2 的配位，而其对应残基仅直接结合 Mn1。其次，KASV EN 中的 LoopE 在无金属离子（apo）和 Mn2+ 结合的结构中均保持闭合构象，Mn2 的配位仅通过位于其上方的 E682 侧链构象调整来实现（补充图 S6A）。不同的是，在其他两类酶中，该灵活的环区存在两种不同的构象：在 His+ ENs 中，其在金属离子或抑制剂结合时会发生从开放到闭合的构象转变，而在 His−ENs 中，其处于无法进行金属配位的开放构象。第三，除了 D719 直接与 Mn1 和 Mn2 配位外，KASV EN 中的所有其他保守残基均通过桥接水分子间接与金属离子配位。相比之下，在其他两类酶中，所有这些残基几乎都直接参与金属离子的结合。综合来看，这些观察结果表明 KASV EN 活性位点存在特定的金属离子结合模式，并暗示了尼罗病毒 EN 的独特催化机制。

为了证实我们的结构发现，我们在八个保守的活性位点残基上进行了单点丙氨酸突变，以研究它们对金属离子诱导的蛋白质稳定性和催化活性的影响。正如预期的那样，突变 D719 完全消除了金属离子诱导的稳定作用（ΔTm = -0.7℃），这与它直接与 Mn1 和 Mn2 配位相符。在 E668 和 E682 处的突变，这两个残基间接参与了两个金属离子的结合，也降低了稳定作用（ΔTm 分别为 0.8℃和 1.7℃），与野生型相比（ΔTm = 5.1℃），表明这些残基对于最佳金属结合至关重要。相比之下，在 P718、K841 和 K848 处的突变对蛋白质稳定性的影响极小（图 4B 和表 1），这可能是由于它们对金属离子结合的贡献有限。E831A 和 W849A 突变体显示出非典型的热变性曲线（补充图 S1B），这可能是由于在热变性过程中发生了蛋白质聚集或构象不稳定所致。通过动态光散射（DLS）测定进一步证实了这一点，结果显示在较高温度（40℃）下，两个突变体的颗粒大小均显著增大，与野生型（WT）相比差异明显（补充图 S1D 和 E），表明在加热过程中发生了聚集。我们还使用等温滴定量热法（ITC）检测了 Mn²+ 与 WT、D668A 和 D719A 突变体的结合情况（补充图 S5）。WT 和 D668A 的滴定曲线数据能很好地用单位点结合模型拟合，分别得到 Kd 值为 25.4 和 163.0 μM，而 D719A 则完全失去了与 Mn²+ 的结合。D668A 与 WT 相比结合亲和力降低，表明该突变破坏了结合位点。这些观察结果与热稳定性测定和结构观察的结果基本一致。

同时，我们使用 19 个碱基的富含尿嘧啶的单链 RNA 底物在 Mn²+ 存在的情况下研究了这些突变体的内切核酸酶活性。关键金属离子配位残基（E668、E682、D719 和 E831）的突变显著降低了内切核酸酶（EN）活性。而假定的催化残基 K841A 虽然仍具有活性，但活性水平低于野生型，这表明它对 EN 活性有贡献但并非必不可少。P718、K848 和 W849 的突变对 EN 活性没有影响（图 4C 和表 1），这与它们在金属离子配位中的作用很小或没有作用相符。综上所述，这些发现表明，参与配位两个金属离子的保守残基对于金属离子结合和 EN 催化活性都至关重要。

为了更深入地了解金属离子结合与 EN 活性之间的结构关系，我们对三个关键突变体（E668A、E682A 和 D719A）进行了结晶，并成功确定了它们的高分辨率结构。尽管 D719A 突变体完全消除了活性位点的金属离子结合能力，但 E668A 和 E682A 突变体仍保留了

为了评估 KASV EN 在病毒转录中的功能相关性，我们进一步研究了活性位点残基在全长 RNA 聚合酶背景下的作用。由于目前没有 KASV 的迷你复制子系统，我们使用了一个已建立的 CCHFV 迷你复制子系统，在该系统中，GFP 报告基因作为转录活性的读出指标。

表 1.热稳定性、紫外线诱导稳定性、KASV EN 突变体的内切核酸酶活性以及 CCHFV L 突变体的转录活性

^aT_m 在无离子存在以及 2 mM MnCl₂ 存在的情况下，根据 DSF 测定计算得出的值。

^bMeasured通过体外核酸内切酶活性测定。活性通过定量测定底物单链 RNA 被降解的百分比来确定。活性位点突变体的值以野生型的活性（设为 100%）为基准进行了标准化。

^cMeasured 通过 CCHFV 微型复制子测定法。活性以野生型为参照进行标准化，并以百分比形式表示。

NA代表无数据。

我们选择 CCHFV EN 插入 1 区的 D718 作为阳性对照，该位点位于活性位点的远端，在纳伊罗病毒中并不保守。野生型和 D718E L 蛋白均表现出强大的转录活性。然而，突变金属离子配位残基 E642、E656、D693、E825 和 K835（与 KASV EN 的 E668、E682、D719、E831 和 K841 同源）几乎完全消除了转录活性，这与它们在体外的 EN 活性受损一致。有趣的是，突变 P692、K842 和 W843（与 KASV EN 的 P718、K848 和 W849 同源）也导致活性显著降低（图 4D 和表 1）；尽管这些残基在金属离子结合中作用甚微，且不影响体外的 EN 活性，这表明它们在转录中具有除 EN 活性之外的其他功能作用。总之，这些数据表明全长 RNA 聚合酶的转录高度依赖于双金属离子依赖性内切核酸酶活性。

DPBA、L-742，001 和 BXA 对 KASV 和 CCHFV 内切酶活性的抑制作用

如上所述，三种具有代表性的抑制剂（DPBA、L-742，001 和 BXA；图 5A）被证明能增强 KASV EN 的稳定性。为了进一步评估它们与尼罗病毒 EN 的结合亲和力和抑制潜力，我们进行了 MST 检测和内切酶活性实验。KASV EN 对 BXA 的亲和力最高，其解离常数为 Kd = 4.5 μM，分别约为 DPBA（Kd = 70.7 μM）和 L-742，001（Kd = 140.1 μM）的 15 倍和 30 倍（图 5B）。在内切酶活性实验中，L-742，001 和 BXA 分别在 400 μM 和 200 μM 浓度下有效抑制 KASV EN 活性，而 DPBA 在 400 μM 浓度下未检测到抑制作用（补充图 S7B）。剂量依赖性实验表明，L-742，001 对 KASV EN 的半数最大抑制浓度 (IC50) 为 176.5 μM，比其他布尼亚病毒 EN 报道的 IC 值高约 10 至 100 倍[17， 31， 44]。BXA 的抑制活性明显高于 L-742，001，其 IC 值为 28 μM（图 5C）。然而，其效力仍显著低于流感病毒 EN 报道的纳摩尔IC50值。用克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）的 EN 进行的平行测定显示，其结合和抑制谱与卡萨布兰卡病毒（KASV）的 EN 相似（补充图 S7）。微量热泳动（MST）和酶活性数据证实，L-742，001 和 BXA均可在体外与尼罗病毒属的 EN 结合并抑制其活性，其中 BXA 表现出更强的结合亲和力和抑制效果。

抑制剂在 KASV EN 中的结合模式

为阐明 DPBA、L-742，001 和 BXA 对尼罗病毒包膜蛋白（EN）的作用机制，我们分别将 KASV EN 与这三种抑制剂共结晶。这三种共晶结构分别在 2.15 埃、1.95 埃和 2.16 埃的分辨率下得以确定。所有三种结构均清晰地显示出化合物的电子密度，它们通过各自的头部基团（DPBA、L-742，001 中的二酮酸以及 BXA 中的噁嗪并吡啶并三嗪二酮部分）以类似的方式与活性位点中心的两个锰离子配位（图 6A）。在每个复合物中，Mn1 和 Mn2 分别由中心的 D719 侧链、抑制剂头部基团的两个相邻且共面的氧原子以及与活性位点保守残基相互作用的桥接水分子配位。除了金属配位部分外，抑制剂的其余部分呈现出不同的构象。DPBA 的苯基部分未与蛋白质直接接触，仅观察到该部分的弱电子密度。在 L-742，001 复合结构中，哌啶中心环与二酮酸基团垂直排列，电子密度清晰，而苯基和对氯苯基部分则显得无序，这可能是由于它们与周围残基缺乏相互作用所致。值得注意的是，与 BXA 结合的结构在整个分子中均表现出清晰的电子密度。除了与锰离子配位外，BXA 的 V 形尾部基团还与催化中心远端的残基发生额外的相互作用（图 6A 和 B）。具体而言，R661 与 V 形尾部基团紧密接触，与 BXA 的芳香环形成阳离子-π 堆积，而 L660 和 G664 则提供疏水接触。这些相互作用的残基在尼罗病毒 EN 中高度保守，突显了它们在进一步抑制剂探索中的重要性（补充图 S4C）。蛋白质-配体界面面积分析表明，BXA 形成了 539.8 A 的界面面积。 其值大于由 DPBA 形成的值（306.2 A） 和L-742，001（376.9 A˚₂)）。两者合在一起，这些结构研究结果表明，BXA 与 KASV EN 的相互作用比 DPBA 和 L-742，001 更广泛且更稳定，这解释了其更强的结合亲和力和抑制效力。

由沙粒病毒编码的夺帽内切核酸酶属于 PD-(D/E)xK 核酸酶超家族，其催化过程需要二价金属离子。与位于 L 蛋白 N 端的其他病毒内切核酸酶不同，此前预测尼罗病毒的 EN 结构域位于 L 蛋白的约 700 个氨基酸处，其功能首次通过 CCHFV 病毒样颗粒系统得以确认，其中活性位点特征残基 D693 被证明对 mRNA 转录是必需的。后续研究显示，尽管 CCHFV 和其他相关尼罗病毒的 EN 能够通过保守的酸性残基（E642 和 E656）结合金属离子，但它们在体外没有酶活性。在我们的研究中，我们发现表达的 CCHFV 和 KASV EN 对 19 个碱基的 U 富集单链 RNA 仅在存在 Mn2+ 的情况下表现出低体外活性，这似乎与之前的结果略有差异，这可能是由于实验条件不同所致。热稳定性测定表明，KASV EN 可以结合 Mn2+ 和 Mg2+（图 2A）；然而，在存在 Mg2+ 的情况下未观察到可检测的酶活性（图 2B）。这些发现与之前的多项研究结果一致，在这些研究中，大多数病毒性 ENs 在 Mn2+ 下表现出的活性明显高于在 Mg2+ 下的活性。这种偏好可能归因于这样一个事实，即 Mn2+ 的离子半径更小，且其配位要求也比 Mg2+ 更宽松，这可能会有利于形成有利于催化作用的配位几何结构，并为底物结合提供更大的灵活性。然而，即使在 Mn2+ 存在的情况下，分离的尼罗病毒 ENs 在体外仍表现出低活性，这表明有效的 EN 活性可能需要全长 RNA 聚合酶的结构或功能环境。

利用抗体辅助结晶策略，我们首次清晰描绘了尼罗病毒核酸内切酶的无配体状态和金属离子结合状态，确定了喀拉哈里沙漠综合征病毒（KASV）和克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）核酸内切酶的高分辨率结构。与已知的其他病毒核酸内切酶不同，KASV 核酸内切酶展现出一种独特的双金属离子结合模式（图 4A），其中保守的 D719 是唯一直接配位两个金属离子的配体，而其余活性位点残基则通过桥接水分子间接配位金属离子。这种特殊的金属离子配位模式可能是由天然活性位点的构型决定的，该构型由保守残基的空间排列所决定。值得注意的是，保守性分析表明，尼罗病毒核酸内切酶的活性位点结构高度保守，由进化上保守的残基组成（补充图 S8 和补充表 S3），这强烈表明尼罗病毒科内存在共享的金属离子结合机制。我们的数据还提供了结构证据，表明尼罗病毒的内切核酸酶（EN）可能代表了一组独特的夺帽内切核酸酶，这与之前提出的它们在组氨酸+和组氨酸-内切核酸酶之间占据独特进化位置的观点一致。对于沙粒病毒编码的内切核酸酶，最初针对流感病毒 EN 提出了双金属离子催化机制，并且我们的对艾比湖病毒 EN 的结构和酶学研究也支持了这一观点[15， 19]。在本研究中，直接或间接参与锰离子配位的残基发生突变会损害 KASV EN 的活性（图 4C），以及在基于 CCHFV 的迷你复制子系统中的转录活性（图 4D）。对失活突变体的结构分析显示，金属离子结合部分或完全丧失（补充图 S6B）。这些发现表明，EN 活性高度依赖于两个金属离子的结合，表明尼罗病毒的 EN 采用类似于其他夺帽内切核酸酶的双金属离子催化机制，尽管其金属离子配位模式有所不同。

双金属离子催化已被确立为许多核酸酶的通用机制，其中两个金属离子（分别称为金属 A 和金属 B）在催化循环中发挥着不同的作用。一方面，金属 A 可以激活羟基亲核试剂，促进其对核酸底物中可裂解的磷酸二酯键的攻击。与金属 A 结合的水分子是最常见的亲核试剂，可直接被金属离子活化，或被一般碱去质子化。另一方面，金属 A 和金属 B 通过与可裂解磷酸酯的桥接氧原子或非桥接氧原子相互作用，稳定底物态、过渡态和反应后态。值得注意的是，这两个金属离子可以相互重新定位。

在不同的反应阶段，采用有利于亲核试剂攻击和产物形成的最佳空间配位几何结构。金属离子上述功能的实现涉及金属离子从原有配体的解离以及与新配体的重新配位。基于此，我们推测水分子在 KASV EN 金属离子结合模式中具有两种功能作用。首先，与金属离子结合的一水分子可能充当亲核试剂，尤其是与 Mn1 结合的水分子，其占据的空间位置与金属 A 相似（补充图 S9A）。其次，Mn2+ 与结合残基之间的桥接水分子可能通过充当润滑剂来降低配体结合的自由能垒，从而加速配体交换，实现高效催化。为了探究 RNA 底物识别和切割的潜在机制，我们生成了 KASV EN 与两个锰离子以及源自 19 个核苷酸的富含 U 的单链 RNA 的 6 个核苷酸片段结合的 AlphaFold 预测模型。所得模型显示，除了与 2E9 Fab 相互作用的灵活插入片段 1 和 Loop810–826 之外，整体 EN–RNA 结构具有很高的置信度（补充图 S9B）。在预测模型中，RNA 位于 EN 两个叶瓣形成的裂隙内，5‘ 磷酸基团占据双金属离子催化中心并与两个锰离子配位，而其余核苷酸与周围残基形成广泛的相互作用，这类似于裂解后的产物状态。值得注意的是，RNA 5’ 核苷酸的结合位点与我们晶体结构中的 BXA 结合位点重叠良好，表明 BXA 通过螯合金属离子并竞争底物结合位点来抑制 EN 活性（补充图 S9B）。

夺帽内切核酸酶已成为抗病毒药物开发的有前景靶点。我们系统评估了三种代表性抑制剂对喀山沙粒病毒（KASV）和克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）内切核酸酶（EN）的抑制效果。结果表明，在三种测试化合物中，BXA 的结合亲和力最高，抑制活性最强（图 5 和补充图 S7）。对 EN-抑制剂复合物的结构分析进一步表明，这三种抑制剂均以相似方式螯合两个催化金属离子。然而，BXA 独特地与酶形成了额外的稳定相互作用（图 6），这可能是其抑制效果更佳的原因。尽管 BXA 有效，但其对 KASV 和 CCHFV EN 的抑制 IC₅₀值为微摩尔级，远不如其对流感病毒 EN 纳摩尔级的抑制效果显著。通过比较 BXA 在流感病毒（IAV）和喀山沙粒病毒（KASV）EN 中的结合模式，我们发现 IAV EN 的活性位点口袋相对紧凑狭窄，使 BXA 能够几乎完全占据该口袋，并与周围残基形成广泛的相互作用网络（补充图 S10），与 EN 形成的界面面积为 809.9 A˚2。相比之下，KASV 和 CCHFV 的 ENs 活性位点口袋相对较大且较为开放，导致与 BXA 的残基接触有限，且 BXA 仅部分占据该口袋，其结合面积为 539.8 A˚2。这种结合口袋的结构差异可能是 BXA 对 IAV 疗效更高的原因。值得注意的是，尼罗病毒和其他布尼亚病毒科的 ENs 形成了一个共同的开放活性位点口袋，这给抑制剂的设计带来了挑战。不过，先前的一项研究已表明，BXA 能够有效抑制 CCHFV 在细胞中的感染，其 IC₅₀值处于微摩尔水平，其钠盐形式在小鼠模型中显著提高了存活率[43]，这凸显了其作为抗 CCHFV 药物候选者的潜力。鉴于 BXA 结合口袋内的空间空缺，未来的优化工作应着重于对 BXA 的骨架进行修饰，使其延伸至相邻的亚口袋，并与口袋内壁的残基建立更多的稳定相互作用。基于 EN-抑制剂复合物的结构信息，已确定了活性位点口袋内的四个潜在空间位点，以容纳 BXA 的修饰，从而提高其效力（补充图 S10）。值得注意的是，位点 1 可能与 RNA 底物结合裂隙对齐，引入额外化学基团以增强抑制效力的潜力最大。此外，位点 2 可能容纳一个额外的疏水基团，而在位点 3 和 4 放置小的亲水基团可能允许与 EN 发生极性相互作用。

总之，我们的研究首次从原子分辨率层面揭示了奈罗病毒的内切核酸酶（ENs）的结构。对克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）和肯尼亚塞夫病毒（KASV）内切核酸酶的一系列高分辨率结构研究表明，一种独特的双金属离子结合模式对于其酶活性至关重要。这种独特的配位方式涉及多个桥接水分子，对高效催化以及适应不同底物或环境条件具有特定意义。重要的是，这种双金属离子模式在奈罗病毒的内切核酸酶中是保守的，并且容易受到现有内切核酸酶靶向化合物的抑制。这些发现为开发针对克里米亚-刚果出血热病毒及其他相关奈罗病毒的新型、高效、广谱抗病毒药物提供了关键基础。

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