应用案例：蛋白稳定性分析仪PSA-16助尼罗病毒“夺帽”内切酶研究

蛋白稳定性分析仪PSA-16（北京佰司特科技有限责任公司）助力中国科学院武汉病毒研究所科研人员研究了尼罗病毒“夺帽”内切核酸酶的结构与功能，并于2026年1月在《Nucleic Acids Research》期刊发表了题为“Structure and function of the nairovirus cap-snatching endonuclease”的研究论文。

使用 PSA-16 仪器（北京佰司特科技有限责任公司）测定了纯化的 KASV EN 及其突变体的差示扫描荧光（DSF）热变性曲线。将蛋白质样品稀释至 0.3 毫克/毫升，加入测定缓冲液（20 毫摩尔/升 Tris-HCl，pH 7.5，150 毫摩尔/升 NaCl，5% 体积比的甘油），并添加 2 毫摩尔的各种二价金属离子，或添加 0.2 毫摩尔的抑制剂（DPBA、L-742，001 和 BXA）以及 2 毫摩尔的 MnCl₂。在30℃至 95℃的线性升温范围内，以每分钟 1℃的升温速率监测 330 纳米和 350 纳米处的内在蛋白质荧光强度。F350/F330 荧光比值曲线的一阶导数计算出熔解温度 (Tm)。

尼罗病毒包括几种人类病原体，如克里米亚 - 刚果出血热病毒（CCHFV）和卡索克罗病毒（KASV）。病毒聚合酶的夺帽内切核酸酶（EN）结构域对于转录至关重要，是很有前景的抗病毒靶点。然而，尼罗病毒 EN 的结构和功能机制仍知之甚少。在此，我们介绍了 CCHFV 和 KASV EN 的生化和结构研究。生化实验表明，这两种内切核酸酶活性可被锰离子激活，并且对富含尿嘧啶的 RNA 底物表现出偏好。这种活性可被三种金属螯合抑制剂（DPBA、L-742，001 和 BXA）抑制，其中 BXA 显示出最高的结合亲和力和抑制效力。我们还确定了 CCHFV 和 KASV内切酶在无配体、金属离子结合和抑制剂结合状态下的九个晶体结构。比较结构分析揭示了尼罗病毒 EN 独有的双金属离子结合模式，其中保守残基通过桥接水分子协调两个锰离子。在 KASV内切酶与抑制剂结合的结构中，BXA 与酶形成了额外的稳定作用力，这解释了其更强的抑制效果。功能测定进一步证实，双金属离子机制对于病毒转录至关重要。这些发现为针对克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）及相关病原体的抗病毒药物的合理设计提供了结构基础。

 

差示扫描荧光法

使用 PSA-16 仪器（北京佰司特科技有限责任公司）测定了纯化的 KASV EN 及其突变体的差示扫描荧光（DSF）热变性曲线。将蛋白质样品稀释至 0.3 毫克/毫升，加入测定缓冲液（20 毫摩尔/升 Tris-HCl，pH 7.5，150 毫摩尔/升 NaCl，5% 体积比的甘油），并添加 2 毫摩尔的各种二价金属离子，或添加 0.2 毫摩尔的抑制剂（DPBA、L-742，001 和 BXA）以及 2 毫摩尔的 MnCl₂。在30℃至 95℃的线性升温范围内，以每分钟 1℃的升温速率监测 330 纳米和 350 纳米处的内在蛋白质荧光强度。F350/F330 荧光比值曲线的一阶导数计算出熔解温度 (Tm)。

 

KASV EN 的生化及酶学特性研究

两种具有 His+ 和 His− 基团的核酸内切酶都需要二价金属离子才能发挥催化活性。为了确定尼罗病毒内切酶（EN）的金属离子结合特异性，进行了差示扫描荧光（DSF）实验以监测不同条件下蛋白质的稳定性。KASV内切酶在无金属离子的情况下显示出典型的热变性曲线，其熔解温度 (T_m) 为 42.3℃。加入 MnCl₂ 或 MgCl₂ 后，其熔解温度分别升高了 4.7℃ 和 2.9℃（图 2A），这可能是由于金属离子结合在活性位点所致。在存在 Co2+、Zn2+ 或 Ni2+ 的情况下观察到了异常的热变性曲线（补充图 S1A），这可能是因为这些离子导致蛋白质聚集或降解。动态光散射（DLS）分析表明，加入这三种离子中的任何一种都会导致内切酶的平均流体动力学直径显著增加，表明样品中发生了蛋白质聚集（补充图 S1C 和 E）。进一步在 MnCl₂ 和三种已知的内切酶抑制剂存在的情况下进行了 DSF 实验。DPBA 和 L-742，001 均使内切酶熔解温度 T_m 升高了约 10℃，超过了单独使用 MnCl₂ 时的稳定效果（4.7℃）。值得注意的是，BXA 对 KASV内切酶的稳定作用最为显著，使 T_m 提高了 16.8℃（图 2A）。这些结果表明，KASV内切酶能够与 Mn2+ 和 Mg2+ 结合，并且在测试的抑制剂中可能与 BXA 的相互作用最为强烈。

 

图 2. KASV EN 的热稳定性和二价金属离子依赖性活性。 (A) 在无离子和存在指定二价金属离子及抑制剂的情况下，KASV EN 的热变性曲线。柱状图显示了来自三个独立实验的平均值 ± 标准偏差 （SD）。差异的统计学显著性通过单向方差分析 （ANOVA） 进行评估。MnCl₂ 或 MgCl₂组分别与无离子对照组进行比较，而抑制剂处理组与MnCl₂ 组进行比较。 (B) KASV EN 的二价金属离子依赖性内切核酸酶活性。然后，将 1 μM 的酶与 19-mer U 富含的单链 RNA 在 37℃下与 2 mM 的指定金属离子共同孵育 2 小时。 (C) KASV EN 的 RNA 底物偏好。KASV EN 与四种不同单链 RNA 底物的内切核酸酶活性的时间进程。所有实验均在 2 mM MnCl ⌆ 存在下，使用 1 μM 酶进行。

 

KASV EN 达到完全的催化活性要两种金属离子

为了证实我们的结构发现，我们在内切酶八个保守的活性位点残基上进行了单点丙氨酸突变，以研究它们对金属离子诱导的内切酶稳定性和催化活性的影响。正如预期的那样，突变 D719 完全消除了金属离子诱导的稳定作用（ΔTm = -0.7℃），这与它直接与 Mn1 和 Mn2 配位相符。在 E668 和 E682 处的突变，这两个残基间接参与了两个金属离子的结合，也降低了稳定性（ΔTm 分别为 0.8℃和 1.7℃），与野生型相比（ΔTm = 5.1℃），表明这些残基对于最佳金属结合至关重要。相比之下，在 P718、K841 和 K848 处的突变对蛋白质稳定性的影响极小（图 4B 和表 1），这可能是由于它们对金属离子结合的贡献有限。E831A 和 W849A 突变体显示出非典型的热变性曲线（补充图 S1B），这可能是由于在热变性过程中发生了蛋白质聚集或构象不稳定所致。通过动态光散射（DLS）测定进一步证实了这一点，结果显示在较高温度（40℃）下，两个突变体的颗粒大小均显著增大，与野生型（WT）相比差异明显（补充图 S1D 和 E），表明在加热过程中发生了聚集。我们还使用等温滴定量热法（ITC）检测了 Mn²+ 与 WT、D668A 和 D719A 突变体的结合情况（补充图 S5）。WT 和 D668A 的滴定曲线数据能很好地用单位点结合模型拟合，分别得到 Kd 值为 25.4 和 163.0 μM，而 D719A 则完全失去了与 Mn²+ 的结合。D668A 与 WT 相比结合亲和力降低，表明该突变破坏了结合位点。这些观察结果与热稳定性测定和结构观察的结果基本一致。

同时，我们使用 19 个碱基的富含尿嘧啶的单链 RNA 底物在 Mn²+ 存在的情况下研究了这些突变体的内切酶活性。关键金属离子配位残基（E668、E682、D719 和 E831）的突变显著降低了内切酶活性。而假定的催化残基 K841A 虽然仍具有活性，但活性水平低于野生型，这表明它对内切酶活性有贡献但并非必不可少。P718、K848 和 W849 的突变对内切酶活性没有影响（图 4C 和表 1），这与它们在金属离子配位中的作用很小或没有作用相符。综上所述，这些发现表明，参与配位两个金属离子的保守残基对于金属离子结合和 EN 催化活性都至关重要。

为了更深入地了解金属离子结合与内切酶活性之间的结构关系，我们对三个关键突变体（E668A、E682A 和 D719A）进行了结晶，并成功确定了它们的高分辨率结构。尽管 D719A 突变体完全消除了活性位点的金属离子结合能力，但 E668A 和 E682A 突变体仍保留了

图 4. KASV EN 具有独特的双金属离子结合模式，这对催化活性至关重要。 (A) KASV EN 与锰离子存在时 His+ 和 His− 内切核酸酶的活性位点和金属离子结合模式的比较。参与金属离子配位的关键残基已标注并以棒状显示。锰离子和配位水分子分别以橙色和红色球体显示，配位相互作用以黑色虚线表示。KASV EN 中锰离子和配位水分子的 2F_o–F 电子密度图（等值线为 0.7σ）已叠加。下图展示了不同内切核酸酶中金属离子结合模式的示意图，直接配位以绿色虚线表示，间接配位以黑色虚线表示。标注了 Mn²+ 与关键原子之间的距离（Å）。PDB 条目：5IZE（HTNV），5J1P（LASV）。(B) KASV EN WT 及其突变体在有无 MnCl₂ 条件下的热稳定性_。值表示为三次独立实验的平均值 ± 标准差。通过双向方差分析评估了无离子组和 MnCl₂ 组之间差异的统计学意义。∗∗∗∗P <.0001；ns，不显著。（C）KASV EN WT 及活性位点突变体的内切核酸酶活性。将 19 个核苷酸的富含 U 的单链 RNA 与 1 μM 的 WT 或突变蛋白在 2 mM MnCl₂ 的存在下孵育_。作为阴性对照（NC），将单链 RNA 与 WT 蛋白在无 MnCl₂ 的条件下孵育_。一些残留的背景活性可能与样本污染有关，而非 KASV EN 活性。（D）WT 和突变 CCHFV L 蛋白的转录活性。BSR-T7/5 细胞被转染了由 T7 RNA 聚合酶驱动的迷你复制子系统以及两个辅助质粒。eGFP 报告基因的表达量被定量并归一化至 WT 组（设为 100%）。统计学显著性通过双尾 Student’s t 检验确定。∗∗∗∗P < 0.0001。数据代表了两次独立实验的平均值 ± 平均值的标准误差（n = 2×3，每个生物重复包含三个技术重复）。显示了 3×FLAG 标签的 WT 和突变 L 蛋白的免疫印迹分析。β-肌动蛋白用作内参。

 

仅与单个金属离子结合，对应于 Mn1（补充图 S6B）。这些结构观察结果与热稳定性和内切酶活性测定的生化数据完全一致。综合来看，生化和结构数据共同表明 D719 是协调两个金属离子以及催化活性的关键残基，支持了结合两个金属离子对于内切酶的全部功能至关重要这一观点。

 

表 1.热稳定性、紫外线诱导稳定性、KASV EN 突变体的内切核酸酶活性以及 CCHFV L 突变体的转录活性

a. T_m 在无离子存在以及 2 mM MnCl₂ 存在的情况下，根据 DSF 测定计算得出的值。

b. Measured通过体外核酸内切酶活性测定。活性通过定量测定底物单链 RNA 被降解的百分比来确定。活性位点突变体的值以野生型的活性（设为 100%）为基准进行了标准化。

c. Measured 通过 CCHFV 微型复制子测定法。活性以野生型为参照进行标准化，并以百分比形式表示。

NA代表无数据。

 

我们选择 CCHFV EN 插入 1 区的 D718 作为阳性对照，该位点位于活性位点的远端，在纳伊罗病毒中并不保守。野生型和 D718E L 蛋白均表现出强大的转录活性。然而，突变金属离子配位残基 E642、E656、D693、E825 和 K835（与 KASV EN 的 E668、E682、D719、E831 和 K841 同源）几乎完全消除了转录活性，这与它们在体外的内切酶活性受损一致。有趣的是，突变 P692、K842 和 W843（与 KASV EN 的 P718、K848 和 W849 同源）也导致内切酶活性显著降低（图 4D 和表 1）；尽管这些残基在金属离子结合中作用甚微，且不影响体外的内切酶活性，这表明它们在转录中具有除内切酶活性之外的其他功能作用。总之，这些数据表明全长 RNA 聚合酶的转录高度依赖于双金属离子依赖性内切酶活性。

讨论

由沙粒病毒编码的夺帽内切核酸酶属于 PD-(D/E)xK 核酸酶超家族，其催化过程需要二价金属离子。与位于 L 蛋白 N 端的其他病毒内切核酸酶不同，此前预测尼罗病毒的内切酶结构域位于 L 蛋白的约 700 个氨基酸处，其功能首次通过 CCHFV 病毒样颗粒系统得以确认，其中活性位点特征残基 D693 被证明对 mRNA 转录是必需的。后续研究显示，尽管 CCHFV 和其他相关尼罗病毒的 EN 能够通过保守的酸性残基（E642 和 E656）结合金属离子，但它们在体外没有酶活性。在我们的研究中，我们发现表达的 CCHFV 和 KASV EN 对 19 个碱基的 U 富集单链 RNA 仅在存在 Mn2+ 的情况下表现出低体外活性，这似乎与之前的结果略有差异，这可能是由于实验条件不同所致。热稳定性测定表明，KASV EN 可以结合 Mn2+ 和 Mg2+；然而，在存在 Mg2+ 的情况下未观察到可检测的酶活性。这些发现与之前的多项研究结果一致，在这些研究中，大多数病毒性内切酶在 Mn2+ 下表现出的活性明显高于在 Mg2+ 下的活性。这种偏好可能归因于这样一个事实，即 Mn2+ 的离子半径更小，且其配位要求也比 Mg2+ 更宽松，这可能会有利于形成有利于催化作用的配位几何结构，并为底物结合提供更大的灵活性。然而，即使在 Mn2+ 存在的情况下，分离的尼罗病毒内切酶在体外仍表现出低活性，这表明有效的内切酶活性可能需要全长 RNA 聚合酶的结构或功能环境。

在本研究中，直接或间接参与锰离子配位的残基发生突变会损害 KASV内切酶的活性，以及在基于 CCHFV 的迷你复制子系统中的转录活性。对失活突变体的结构分析显示，金属离子结合部分或完全丧失。这些发现表明，内切酶活性高度依赖于两个金属离子的结合，表明尼罗病毒的内切酶采用类似于其他夺帽内切核酸酶的双金属离子催化机制，尽管其金属离子配位模式有所不同。

双金属离子催化已被确立为许多核酸酶的通用机制，其中两个金属离子（分别称为金属 A 和金属 B）在催化循环中发挥着不同的作用。一方面，金属 A 可以激活羟基亲核试剂，促进其对核酸底物中可裂解的磷酸二酯键的攻击。与金属 A 结合的水分子是最常见的亲核试剂，可直接被金属离子活化，或被一般碱去质子化。另一方面，金属 A 和金属 B 通过与可裂解磷酸酯的桥接氧原子或非桥接氧原子相互作用，稳定底物态、过渡态和反应后态。值得注意的是，这两个金属离子可以相互重新定位。

夺帽内切核酸酶已成为抗病毒药物开发的有前景靶点。我们系统评估了三种代表性抑制剂对喀山沙粒病毒（KASV）和克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）内切酶的抑制效果。结果表明，在三种测试化合物中，BXA 的结合亲和力最高，抑制活性最强（图 5 和补充图 S7）。对内切酶-抑制剂复合物的结构分析进一步表明，这三种抑制剂均以相似方式螯合两个催化金属离子。然而，BXA 独特地与酶形成了额外的稳定相互作用，这可能是其抑制效果更佳的原因。尽管 BXA 有效，但其对 KASV 和 CCHFV内切酶的抑制 IC₅₀值为微摩尔级，远不如其对流感病毒内切酶纳摩尔级的抑制效果显著。

总之，我们的研究首次从原子分辨率层面揭示了奈罗病毒的内切酶的结构。对克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）和肯尼亚塞夫病毒（KASV）内切酶的一系列高分辨率结构研究表明，一种独特的双金属离子结合模式对于其酶活性至关重要。这种独特的配位方式涉及多个桥接水分子，对高效催化以及适应不同底物或环境条件具有特定意义。重要的是，这种双金属离子模式在奈罗病毒的内切酶酶中是保守的，并且容易受到现有内切酶靶向化合物的抑制。这些发现为开发针对克里米亚-刚果出血热病毒及其他相关奈罗病毒的新型、高效、广谱抗病毒药物提供了关键基础。

 

蛋白稳定性分析仪PSA-16

北京佰司特科技有限责任公司于2023-10-01日推出了自主研发的第一款国产的基于内源差示扫描荧光技术（intrinsic fluorescence DSF）的蛋白稳定性分析仪（PSA-16），该设备性能和参数达到进口设备的水平，价格却远低于进口产品，弥补了目前国产自主设备在蛋白稳定性专业研究分析领域的空白。并于当年年底就成功安装了第一台设备到中牧股份兰州生物药厂。随后在2024-2025年又连续成功安装了多台到工业企业和科研单位，包括：上海近岸科技有限公司，郑州大学河南省医药科学研究院，吉林大学，辽宁大学，中国科学院成都生物研究所，北京工商大学，石河子大学，友谊医院消化健康全国重点实验室，深圳技术大学，中国科学院深圳先进技术研究院、清华大学等，并获客户良好反馈。

北京佰司特科技有限责任公司积极服务客户，助力武汉大学、河南大学、齐鲁工业大学（山东省科学院）、中科院武汉病毒所等单位合作发表多篇高质量论文（Nature子刊《npj Vaccines》、《International Journal of Biological Macromolecules》、《ACS Nano》、《Nucleic Acids Research》等）。

PSA-16的性能和参数达到进口设备的水平，价格却远低于进口产品，弥补了目前国产自主设备在蛋白稳定性研究分析领域的空白。

主要参数★ 测定参数：Tm、Cm、ΔG等；

★ 样品通量：16个；

★ 样品体积：≤20 uL；

★ 浓度范围：0.01-200 mg/ml；

★ 温控范围：15-110度；

★ 变温速度：0.1-15度/分钟；

★ Tm重复性：CV小于1%；

★ 耗材参数：一次性，无需清洗；

★ 八联排设计，适配多通道移液器；

 

蛋白稳定性分析仪PSA-16基于内源差示扫描荧光（ifDSF）技术，广泛应用于蛋白质稳定性研究、蛋白质类大分子药物（抗体）优化工程、蛋白质类疾病靶点的药物小分子筛选和结合力测定等领域，具有快速、准确、高通量等诸多优点。蛋白质中色氨酸/酪氨酸的荧光性质与它们所处的环境息息相关，因此可以通过检测蛋白内部色氨酸/酪氨酸在加热或者添加变性剂过程中的荧光变化，测定蛋白质的化学和热稳定性。

PSA-16采用紫外双波长检测技术，可精准测定蛋白质去折叠过程中色氨酸和酪氨酸荧光的变化，获得蛋白的Tm值和Cm值等数据；测定时无需额外添加染料，不受缓冲液条件的限制且测试的蛋白质样品浓度范围非常广（10 µg/ml - 250 mg/ml），因此可广泛用于去垢剂环境中的膜蛋白和高浓度抗体制剂的稳定性研究。此外，PSA-16具有非常高的数据采集速度，从而可提供超高分辨率的数据。同时PSA-16一次最多可同时测定16个样品，通量高；每个样品仅需要15 uL，样品用量少，非常适合进行高通量筛选。PSA-16操作简单，使用后无需清洗，几乎无维护成本。

蛋白稳定性分析仪PSA-16应用涵盖植物、生物学、动物科学、动物医学、微生物学、工业发酵、环境科学、农业基础、蛋白质工程等多学科领域。蛋白质是最终决定功能的生物分子，其参与和影响着整个生命活动过程。现代分子生物学、环境科学、动医动科、农业基础等多种学科研究的很多方向都涉及蛋白质功能研究，以及其下游的各种生物物理、生物化学方法分析，提供稳定的蛋白质样品是所有蛋白质研究的先决条件。因此多功能蛋白质稳定性分析系统在各学科的研究中都有基础性意义。

1.    抗体或疫苗制剂、酶制剂的高通量筛选

2.    抗体或疫苗、酶制剂的化学稳定性、长期稳定性评估、等温稳定性研究等

3.    生物仿制药相似性研究（Biosimilar Evaluation）

4.    抗体偶联药物（ADC）研究

5.    多结构域去折叠特性研究

6.    物理和化学条件强制降解研究

7.    蛋白质变复性研究（复性能力、复性动力学等）

8.    膜蛋白去垢剂筛选，膜蛋白结合配体筛选（Thermal Shift Assay）

9.    基于靶标的高通量小分子药物筛选（Thermal Shift Assay）

10.    蛋白纯化条件快速优化等

 

 

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类器官串联芯片培养系统—HUMIMIC；类器官灌流式培养和代谢监测系统—IMOLA；

蛋白稳定性分析仪—PSA-16；单分子稳定性分析仪（磁镊力谱测量仪）—HiMT；单分子质量光度计—TwoMP；超高速视频级原子力显微镜—HS-AFM；微流控扩散测量仪—Fluidity One-M；

微纳加工点印仪—NLP2000/DPN5000；台式原子力显微镜—ACST-AFM；全自动半导体式细胞计数仪—SOL COUNT；农药残留定量检测仪—BST-100；