应用案例：蛋白稳定性分析仪PSA-16助力研究NTRC还原酶的结构

蛋白稳定性分析仪PSA-16（北京佰司特科技有限责任公司）助力助力中国农业大学的科研人员研究了烟草弯胞菌 NADPH 依赖型硫氧还蛋白还原酶 C 的结构及其与 2-半胱氨酸过氧化物酶相互作用的分子机制，并于2026年1月在《Acta Crystallographica》期刊发表了题为“Structural study of Nicotiana benthamiana NADPH-dependent thioredoxin reductase C and its molecular mechanism of interaction with 2-Cys peroxiredoxin”的研究论文。

采用差示扫描荧光法（DSF）对目标蛋白的热稳定性进行了评估：蛋白质稳定性分析（PSA）。首先，使用 PSA-16 仪器（北京佰司特科技有限责任公司）对目标蛋白的热稳定性进行了测定。将蛋白质样品（0.4 毫克/毫升）装入石英样品管（货号 LG-002，北京佰司特科技有限责任公司）中进行分析（Zhou 等人，2024 年）。蛋白质的稳定性在 30 至 90℃的线性升温过程中（升温速率为 1℃/分钟），于 350 纳米处监测内在荧光信号。根据 F350 曲线的斜率计算热变性中点温度（熔解温度Tm）。每个样品测量四次。

NADPH 依赖型硫氧还蛋白还原酶 C（NTRC）在所有质体类型中普遍存在，包括叶绿体和非光合质体，是氧化还原稳态的核心调节因子。它在过氧化物抗性、氧化还原信号传导、四吡咯生物合成、淀粉代谢和光周期调节中发挥着关键作用。NTRC/2-Cys 过氧化物酶（2CP）介导的抗氧化防御系统在对抗病原体引起的生物胁迫方面也至关重要。相关研究表明，NTRC 与 2CP 之间的相互作用对于调节和整合叶绿体中的氧化还原功能至关重要。然而，NTRC 与 2CP 相互作用的分子机制仍不清楚。在本研究中，我们表征了烟草（Nicotiana benthamiana）NTRC（NbNTRC）的三维结构，并通过 X 射线晶体学解析了其 NTR 结构域的晶体结构。此外，我们还通过体外实验，包括Pull-down实验、尺寸排阻色谱、微量热泳动和热稳定性实验，研究了 NbNTRC 与 Nb2CP 相互作用的分子基础及稳定性。总之，我们的研究确定了两个半胱氨酸残基对于 NbNTRC 与 Nb2CP 复合物的内在稳定性以及它们之间的分子间相互作用至关重要，确定了 NbNTRC NTR 结构域的结构，并为 NbNTRC - Nb2CP 调控复合物提供了新的机制见解。

关键半胱氨酸残基的突变显著影响 NTRC 和 2CP 的稳定性

我们采用 PSA 和 ThermoFluor 检测法来评估 NbNTRC 中的单个突变 C473S 或 C476S 以及 Nb2CP 中的 C121S 或 C243S 对各自热稳定性的影响。这两种技术均通过测定热变性温度 (Tm) 来定量评估蛋白质的稳定性。

在 PSA 和 ThermoFluor 检测中，NbNTRCC473S 相较于野生型 NbNTRC，其 Tm 仅略有下降，而 NbNTRCC476S 则出现了显著的降低。具体而言，NbNTRC 中 Cys476 的突变使 Tm 值在 PSA 检测中下降了 8.91℃，在 ThermoFluor 检测中下降了 8.67℃，这表明该突变极大地削弱了其结构稳定性（图 6a 和 6b）。同样，我们评估了 Nb2CP 及其突变体的热稳定性。与野生型 Nb2CP 相比， Mutant Nb2CPC243S下降幅度相对较小，在 PSA 检测中下降了 3.24℃，在 ThermoFluor 检测中下降了 2.34℃（图 6c 和 6d）。相反， 突变体Nb2CPC121S 则出现了更为明显的稳定性下降，其 Tm 值在 PSA 和 ThermoFluor 检测中，温度分别下降了 6.22℃ 和 5.5℃（图 6c 和 6d）。值得注意的是，半胱氨酸 121 位于特征性的 PxxxTxxC 基序（Hall 等人，2010 年）内，由保守的苏氨酸（-3）和脯氨酸（-7）残基确定，表明半胱氨酸 121 是 Nb2CP 中的关键过氧化半胱氨酸（Cp）。结合我们之前关于这些半胱氨酸在介导 NbNTRC - Nb2CP 相互作用中的作用的研究结果（图 5），这些结果表明，NbNTRC 中的半胱氨酸 476 和 Nb2CP 中的半胱氨酸 121（图 1a）不仅对各自蛋白质的结构稳定性至关重要，而且对促进它们的功能性相互作用也起着关键作用。
 

图 6 
Nb2CP 中的 Cys121 和 NbTrx 中的 Cys476 对各自蛋白质的内在稳定性至关重要。 (a) 通过 PSA 对 NbNTRC、NbNTRCC473S 和 NbNTRCC476S 进行的热稳定性测定。每条曲线的转变温度 (Tm) 在图中均有明确标注。 (b) 通过 ThermoFluor 对 NbNTRC、NbNTRCC473S 和 NbNTRCC476S 进行的热稳定性测定。 (c) 通过 PSA 对 Nb2CP、Nb2CPC121S 和 Nb2CPC243S 进行的热稳定性测定。 (d) 通过 ThermoFluor 对 Nb2CP、 Nb2CPC121S 和 Nb2CPC243S 进行的热稳定性测定。

在本研究中，我们采用 X 射线衍射晶体学确定了 NbNTRC 的 NTR 结构域的结构。在每个不对称单元中，有两份 NbNTRC NTR 结构域蛋白，每份结合一个 FAD 分子。结合尺寸排阻色谱（SEC）和小角 X 射线散射（SAXS）实验的结果，本研究揭示 NbNTRC NTR 结构域蛋白主要呈现类似于晶体二聚体的构象。

来自 PSA 和 ThermoFluor 检测的结果进一步表明，NbNTRC 中的 Cys476 和 Nb2CP 中的 Cys121 显著影响各自蛋白质的热稳定性。综上所述，这些结果表明 NbNTRC Trx 中的 Cys476 和 Nb2CP 中的 Cys121（过氧化半胱氨酸）对于蛋白质的稳定性和其复合物的组装都是必需的。

最后，基于本研究的发现以及经典的 OsNTRC 反应机制模型（，我们提出了 NbNTRC 的反应机制。在该模型中，NbNTRC 在 Nb2CP 的协助下，与 Nb2CP 环状结构的外侧结合。这种大复合物的结构可能有利于调节氧化还原动力学。电子依次从 NADPH 转移到 NbNTRC 的 NTR 结构域中的 FAD 分子，然后转移到 NTR 结构域内的活性二硫键，接着转移到相邻NbNTRC 分子的 Trx 结构域内的活性二硫键，最后转移到 Nb2CP 蛋白质内的活性二硫键。

蛋白稳定性分析仪PSA-16

北京佰司特科技有限责任公司于2023年10月01日，推出了自主研发的第一款国产的基于内源差示扫描荧光技术（intrinsic fluorescence DSF）的蛋白稳定性分析仪（PSA-16），该设备性能和参数达到进口设备的水平，价格却远低于进口产品，弥补了目前国产自主设备在蛋白稳定性专业研究分析领域的空白。并于当年年底就成功安装了第一台设备到中牧股份兰州生物药厂。随后在2024-2025年又连续成功安装了多台到工业企业和科研单位，包括：上海近岸科技有限公司、郑州大学河南省医药科学研究院、吉林大学、辽宁大学、成都生物制品研究所有限责任公司、北京工商大学、石河子大学、北京友谊医院消化健康全国重点实验室、深圳技术大学、中国科学院深圳先进技术研究院、蓝星安迪苏南京有限公司、清华大学、成都中医药大学等，并获客户良好反馈。

北京佰司特科技有限责任公司积极服务客户，助力武汉大学、河南大学、齐鲁工业大学（山东省科学院）、中科院武汉病毒所、中国农业大学等单位合作发表多篇高质量论文（Nature子刊《npj Vaccines》、《International Journal of Biological Macromolecules》、《ACS Nano》、《Nucleic Acids Research》《Acta Crystallographica》等）。

2025年年初，北京佰司特科技有限责任公司成功出口第一台蛋白稳定性分析仪PSA-16到俄罗斯，2026年初又出口2台PSA-16到俄罗斯，开启国际市场的推广与销售。

主要参数

★ 测定参数：Tm、Cm、ΔG等；

★ 样品通量：16个；

★ 样品体积：≤20 uL；

★ 浓度范围：0.01-200 mg/ml；

★ 温控范围：15-110度；

★ 变温速度：0.1-15度/分钟；

★ Tm重复性：CV小于1%；

★ 耗材参数：一次性，无需清洗；

★ 八联排设计，适配多通道移液器；

蛋白稳定性分析仪PSA-16基于内源差示扫描荧光（ifDSF）技术，广泛应用于蛋白质稳定性研究、蛋白质类大分子药物（抗体）优化工程、蛋白质类疾病靶点的药物小分子筛选和结合力测定等领域，具有快速、准确、高通量等诸多优点。蛋白质中色氨酸/酪氨酸的荧光性质与它们所处的环境息息相关，因此可以通过检测蛋白内部色氨酸/酪氨酸在加热或者添加变性剂过程中的荧光变化，测定蛋白质的化学和热稳定性。

PSA-16采用紫外双波长检测技术，可精准测定蛋白质去折叠过程中色氨酸和酪氨酸荧光的变化，获得蛋白的Tm值和Cm值等数据；测定时无需额外添加染料，不受缓冲液条件的限制且测试的蛋白质样品浓度范围非常广（10 µg/ml - 250 mg/ml），因此可广泛用于去垢剂环境中的膜蛋白和高浓度抗体制剂的稳定性研究。此外，PSA-16具有非常高的数据采集速度，从而可提供超高分辨率的数据。同时PSA-16一次最多可同时测定16个样品，通量高；每个样品仅需要15 uL，样品用量少，非常适合进行高通量筛选。PSA-16操作简单，使用后无需清洗，几乎无维护成本。

蛋白稳定性分析仪PSA-16应用涵盖植物、生物学、动物科学、动物医学、微生物学、工业发酵、环境科学、农业基础、蛋白质工程等多学科领域。蛋白质是最终决定功能的生物分子，其参与和影响着整个生命活动过程。现代分子生物学、环境科学、动医动科、农业基础等多种学科研究的很多方向都涉及蛋白质功能研究，以及其下游的各种生物物理、生物化学方法分析，提供稳定的蛋白质样品是所有蛋白质研究的先决条件。因此多功能蛋白质稳定性分析系统在各学科的研究中都有基础性意义。

1.    抗体或疫苗制剂、酶制剂的高通量筛选

2.    抗体或疫苗、酶制剂的化学稳定性、长期稳定性评估、等温稳定性研究等

3.    生物仿制药相似性研究（Biosimilar Evaluation）

4.    抗体偶联药物（ADC）研究

5.    多结构域去折叠特性研究

6.    物理和化学条件强制降解研究

7.    蛋白质变复性研究（复性能力、复性动力学等）

8.    膜蛋白去垢剂筛选，膜蛋白结合配体筛选（Thermal Shift Assay）

9.    基于靶标的高通量小分子药物筛选（Thermal Shift Assay）

10.    蛋白纯化条件快速优化等

如果您对我们的产品感兴趣，欢迎联系我们预约技术交流和Demo测试。

北京佰司特科技有限责任公司 

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类器官串联芯片培养系统—HUMIMIC；类器官灌流式培养和代谢监测系统—IMOLA；

蛋白稳定性分析仪—PSA-16；单分子稳定性分析仪（磁镊力谱测量仪）—HiMT；单分子质量光度计—TwoMP；超高速视频级原子力显微镜—HS-AFM；微流控扩散测量仪—Fluidity One-M；

微纳加工点印仪—NLP2000/DPN5000；台式原子力显微镜—ACST-AFM；全自动半导体式细胞计数仪—SOL COUNT；农药残留定量检测仪—BST-100；