齐鲁工业大学（山东省科学院）生物研究所

山东省生物传感与微生物智能代谢调控重点实验室

山东大学齐鲁医学院国家药品监督管理局药物制剂技术研究与评价重点实验室

摘要

肌酐是评估肾功能的关键生物标志物，开发其快速、灵敏、稳定的即时检测（POCT）生物传感器至关重要。基于酶的生物传感器使用肌氨酸氧化酶（SOX）在三酶级联反应中颇具前景，但在固定化后的酶活性和长期稳定性方面仍存在挑战，尤其是对于活性较低的 SOX。在此，我们报告了对糖结合模块 3（CBM3）融合 SOX 变体的合理工程改造，以解决这些局限性。CBM3 通过不同的连接子（富含脯氨酸的 XP 连接到 N 端，α-螺旋 EAAK 连接到 C 端）与单体 SOX 基因融合，生成了 CBM3-XP-SOX 和 SOX-EAAK-CBM3。比较分析表明，SOX-EAAK-CBM3 表现出更优的可溶性表达（15.96 毫克/毫升）、增强的常温催化活性（比野生型 SOX 高 39.96% - 56.23%）以及出色的电化学稳定性（25 天，R2 > 0.99）。相比之下，CBM3-XP-SOX 遭受连接子裂解和结构不稳定，稳定性仅限于 2 天。对 N 端融合的结构指导连接子工程发现 XP 连接子中存在不稳定的 K-E-P 基序；通过截断和灵活引入甘氨酸，得到了 CBM3-XG-SOX。CBM3-XG-SOX/纤维素/铂生物传感器的电化学稳定性比亲本 CBM3-XP-SOX 提高了 7 倍（15 天），响应迅速（19 至 30 秒），对生理干扰物具有很强的抗干扰能力。血清和尿液实际样本分析证实，其准确度（回收率：96.28% - 97.88%）和精密度优于商业试剂盒，对于低或高肌酐浓度的误差更小。这项工作通过生物信息学指导的连接子/融合位点优化，为融合酶工程建立了一个合理的框架，克服了基于低活性酶的生物传感器的局限性。CBM3 融合 SOX 生物传感器能够实现经济、稳定、灵敏的即时检测肌酐，具有广泛的临床诊断和家庭健康监测应用。

图 1. 野生型和融合 SOX 蛋白的构建、表达及纯化，以及 SDS-PAGE 验证。不同温度和 pH 条件下 SOX 蛋白的酶学特性。（A）野生型 SOX 蛋白及两种融合蛋白变体（CBM3-XP-SOX 和 SOX-EAAK-CBM3）的方案设计和分子构建；（B）成功表达并亲和纯化后的三种 SOX 蛋白候选物（野生型和融合变体）的 SDS-PAGE 分析。M 槽：蛋白质分子量标准；（C）三种 SOX 蛋白的最适温度曲线；（D）、（E）、（F）分别为野生型 SOX、CBM3-XP-SOX、SOX-EAAK-CBM3 的热稳定性；（G）三种 SOX 蛋白的最适 pH 曲线；（H）、（I）、（J）分别为野生型 SOX、CBM3-XP-SOX、SOX-EAAK-CBM3 的 pH 稳定性。

图 2. 酶 - 纤维素结合的 SDS-PAGE 验证及不同 SOX 变体功能化纤维素膜的 SEM 形貌。（A - C）分别验证野生型 SOX、CBM3-XP-SOX 融合酶和 SOX-EAAK-CBM3 融合酶与纤维素结合效率的 SDS-PAGE 分析；（D）SOX 融合酶在纤维素膜上靶向固定机制的示意图；（E）未固定酶的裸纤维素膜；（F）直接添加野生型 SOX 的纤维素膜；（G）通过戊二醛交联固定的野生型 SOX 的纤维素膜；（H - I）分别用 CBM3-XP-SOX 和 SOX-EAAK-CBM3 融合酶功能化的纤维素膜。

由 pKa 值分别为 7.4 和 10.2 的可电离残基调节。鉴于肌氨酸的α-氨基具有 10.01 的 pKa 值，底物在 pH 8.0 时主要以两性离子形式存在，有利于酶-底物相互作用动力学。由于 CBM3 总体上呈中性电荷分布，融合构建体的最佳 pH 值未发生改变（图 1G）。为评估 pH 稳定性，将所有 SOX 变体在缓冲溶液（pH 6 - 10）中孵育 10 小时。野生型 SOX 在 pH 6、7、8、9 和 10 时分别保留 35.93%、73.99%、81.34%、29.71% 和 8.52% 的活性；CBM3-XP-SOX 分别保留 15.39%、88.63%、76.78%、41.42% 和 34.6% 的活性；而 SOX-EAAK-CBM3 分别保留 36.02%、51.52%、67.93%、32.96% 和 32.97% 的活性。SOX 变体在 pH 7.0 和 8.0 时表现出的高残余活性证实了这些酶倾向于接近中性的 pH 最适值。值得注意的是，生物传感器检测系统中常用的 PBS 电极缓冲液恰好配制在 pH 8.0，这种固有的 pH 兼容性确保了基于 SOX 的生物传感组件的持续酶活性，直接支持其在实际分析应用中的可靠性。

3.3. 纤维素结合能力测定及 SOX 变体的固定化分析

进行了 SDS-PAGE 分析以研究 SOX 与纳米纤维素之间的结合相互作用（图 2A - C）。野生型 SOX 在孵育 5 小时之前未检测到与纳米纤维素的结合（图 2A）。相比之下，CBM3-XP-SOX 和 SOX-EAAK-CBM3 融合蛋白在 5 分钟内迅速与纳米纤维素结合，结合效率分别达到 91.71% 和 94.98%。孵育 5 小时后，两种构建体均观察到近乎完全结合，其效率进一步提高到 94.49%（图 2B）和 96.39%（图 2C）。值得注意的是，CBM3-XP-SOX 的 SDS-PAGE 图谱显示了一个额外的蛋白条带（图 2B 中用红色虚线框标记），其分子量与野生型 SOX 相对应。这一观察结果初步表明，CBM3-XP-SOX 可能存在结构不稳定性，可能涉及连接子裂解事件，导致 SOX 从纳米纤维素基质中解离。

如图 2D 所示，SOX 变体通过不同的策略固定在纤维素膜上，并使用扫描电子显微镜（SEM）对固定在膜上的 SOX 的形态特征进行了表30,34]。如图 2E 所示，未固定 SOX 的纤维素膜呈现出具有清晰界定的孔隙结构。将野生型 SOX 沉积在膜上并反复冲洗后，其形态特征与裸纤维素载体相比没有显著变化，这表明在没有交联剂的情况下，野生型 SOX 无法有效固定（图 2F）。通过 GA 介导的交联形成了聚集的 SOX 集群。此外，带有 CBM3 标签的 SOX 构建体（CBM3-XP-SOX 和 SOX-EAAK-CBM3）显示出明显的纤维素原纤维附着，并伴有界面处酶聚集体的形成（图 2G-I），这表明带有 CBM3 标签的 SOX 构建体可以通过 CBM3 与纤维素之间的特异性亲和吸附实现稳定固定。

为了进一步验证 SOX 的固定化效果，采用了电化学阻抗谱（EIS）这一用于分析电子转移动力学并量化电极-电解质界面电荷转移电阻（Rct）的可靠技术[7,12，30]。奈奎斯特图（图 S2A）显示，随着每次修饰步骤的进行，Rct 值逐渐增加。裸铂电极的 Rct 值为 312 Ω。涂覆纤维素膜后，Rct 值上升至 337 Ω，这与纤维素的固有绝缘特性相符。在固定化 GA 交联的 SOX 后，Rct 值显著增加至 524 _Ωwas。同样，用 CBM3 融合构建体 CBM3-XP-SOX 和 SOX-EAAK-CBM3 修饰的电极，其 Rct 值分别为 413 _Ωand 395 Ω。由于蛋白质具有绝缘作用，这些 Rct 值的连续增加直接证明了 SOX 成功固定在纤维素涂层电极上。

3.4. SOX 生物传感元件的电化学测试

采用循环伏安法（CV）来表征在不同浓度的肌氨酸梯度下固定化 SOX 变体的电催化活性。如图 S2B1-B3 所示，肌氨酸的逐步添加导致在 +0.6 V 处氧化峰出现明显的浓度依赖性梯度响应，这可能归因于如前所述的由酶促生成和释放的物质的氧化还原电位 H₂O₂。

为了验证 SOX 生物传感器的灵敏度和检测限（LOD），在 PBS（pH 8.0）中依次加入浓度为 25 至 250 μM 的肌氨酸，记录在 _+0.6 V 对 Ag/AgCl 的施加电位下的安培 i-t 响应（图 S3A、B）。对四种 SOX 变体中的每一种都进行了三次连续的安培 i-t 测量，重叠的电流-时间曲线证实了检测系统的批内重复性。如图 3A-C 所示，GA 交联的野生型 SOX 修饰生物传感器（SOX/GA/纤维素/Pt）的响应曲线表现出明显的波动，而 CBM3 融合的 SOX 修饰生物传感器（CBM3-XP-SOX/纤维素/Pt、SOX-EAAK-CBM3/纤维素/Pt）的响应曲线则较为平滑，表明 CBM3 融合的酶元件具有更高的催化稳定性。此外，响应时间分析表明，SOX/GA/纤维素/Pt 在每次注入底物后需要 78 至 81 秒（τ90，达到稳态电流 90%的时间）才能稳定，而 CBM3 融合的 SOX 构建体的响应时间则较短，为 19 至 30 秒。定量评估表明，在第 1 天，SOX/GA/纤维素/Pt 生物传感器对肌氨酸的响应在 25 至 175 _μM 范围内呈线性，相关系数（R²）为 0.9874，回归方程为 y=1.197 _×10−10x - 1.771 _×10−10，灵敏度为 1694.2 _μA.mol−1.L.cm−2，检测限为 19.54 _μM。相比之下，CBM3 融合生物传感器表现出更好的线性（R2=0.9944，CBM3-XP-SOX/纤维素/Pt，回归方程为 y=1.005 _×10−10x ₊ 3.061 _×10−10，灵敏度为 1422.4 _μA.mol−1.L. cm−2，检测限为 11.25 _μM;，R2 =0.997；SOX-EAAK-CBM3/纤维素/Pt，回归方程为 y=7.074 _×10−11x - 4.428 _×10−10，灵敏度为 1001.1_μA.mol−1.L.cm−2，检测限为 7.2 _μM)，在相同的浓度范围内。从机理上看，GA 交联可能会产生空间位阻，屏蔽 SOX 的活性位点，阻碍肌氨酸的直接结合，降低 H₂O₂ 的生成，这些因素导致了观察到的线性较差（R2 > 0.98）和响应时间延长。相反，CBM3 介导的与纤维素的特异性相互作用实现了 SOX 的定向固定。通过连接体固定的 SOX 保持了完整的水合状态和暴露的活性位点，从而促进了底物的高效和稳定接触。为了进一步评估制造的重现性，制备了三个独立的电极制备批次，并计算了各批次关键性能指标（灵敏度、检测限、响应时间）的变异系数（CV）。灵敏度、检测限和响应时间的 CV 值分别在 0.009% 至 0.01%、1.9% 至 2.7% 和 2% 至 2.5% 之间（图 S4）。这些结果共同表明，该电化学生物传感器具有出色的批内重复性和批间重现性，验证了其在实际应用中的可靠性和可扩展性。

此外，还检测了 WT 和融合 SOXs 构建体的电化学稳定性和线性。如图 3D1、D2 所示，WT SOX 在 6 天内保持了中等稳定的电化学性能（R2 > 0.98），这证实了其内在的酶稳定性足以支持持续的 H2O2 介导的信号生成。对于融合构建体，通过 CBM3-纤维素相互作用进行定向固定产生了不同的稳定性特征：C 端 CBM3 融合（SOX-EAAK-CBM3）在 25 天内保持了电化学线性（R2 > 0.99）和稳定性（图 3F1、F2），而 N 端 CBM3 融合（CBM3-XP-SOX）仅在 2 天内保持稳定（R2 > 0.99）。在第 3 至 4 天，CBM3-XP-SOX 生物传感器表现出电化学信号的突然衰减（图 3E1、E2）。因此提出了两种可能的假设来解释 CBM3-XP-SOX 的不稳定性：（1）SOX 失活，但鉴于 WT SOX 的稳定性，这一假设被排除。（（1）SOX 失活，但鉴于野生型 SOX 在至少 6 天内仍保持稳定，这一假设被排除；（2）如图 2B 所示，连接子很可能发生了水解，导致 SOX 从纤维素支架上脱落。

图 3. SOX 修饰电极的电化学特性。（A-B）野生型 SOX（A）和融合 SOX（B）修饰电极的安培（i-t）响应曲线。这些测量在磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 8.0）中进行，施加电位为 +0.6 V，肌氨酸浓度梯度增加，范围从 25 μM 到 250 μM；（C）野生型和融合 SOX 修饰电极的肌氨酸诱导电流差（ΔI）与肌氨酸浓度的线性相关图；（D1-F1）分别修饰有野生型 SOX（D1）、CBM3-XP-SOX（E1）和 SOX-EAAK-CBM3（F1）的电极的安培（i-t）响应曲线。所有测试均在上述相同实验条件下进行；（D2-F2）分别对应野生型 SOX（D2）、CBM3-XP-SOX（E2）和 SOX-EAAK-CBM3（F2）修饰电极的肌氨酸诱导电流差（ΔI）与肌氨酸浓度的计算线性关系。

3.5. 采用 MD、SDS-PAGE 和 DSF 对 SOX 变体的稳定性分析

为了验证上述假设，采用 AlphaFold3 [21] 预测了 SOX、CBM3-XP-SOX 和 SOX-EAAK-CBM3 的结构（图 1A）。先前的研究报告称，用于连接蛋白质结构域的最佳接头长度（定义为连接两个结构域（α-螺旋或β-折叠）的片段）为 10 _±5.8 个氨基酸残基 [36,37]。结构模拟显示，CBM3-XP-SOX 拥有 12 个残基的次优接头，超出了用于融合酶构建策略的推荐 5 - 10 个残基的范围。相比之下，SOX-EAAK-CBM3 的接头区域由 10 个残基组成，并采用α-螺旋构象。序列分析证实，该接头包含 EAAK 基序，文献表明这是一种兼具刚性和高韧性的α-螺旋肽 [38,39]。这种结构特征在功能测试中能够实现有效的结构域分离，同时支持长期的电化学稳定性。随后，使用 GROMACS 在 300 K 下对三种酶构建体进行了 100 纳秒的分子动力学模拟，以探究其稳定性机制。在系统平衡后，进行了均方根波动（RMSF）分析以评估残基的灵活性，同时通过均方根偏差（RMSD）测量来评估整体构象变化（图 4A、B）。为了验证 100 纳秒的分子动力学模拟是否达到构象平衡以进行收敛性分析，我们对每个系统进行了三次独立重复的分子动力学模拟。我们还通过时间平均性质及其标准偏差，并结合单因素方差分析（one-way ANOVA）的统计显著性检验来补充分析。结果表明，RMSD 值在各重复模拟中表现出极好的重现性，无统计学显著差异（P > _0.05），这证实了 100 纳秒模拟的可靠性和收敛性（图 S5A1-D1；图 S5A2-D2）。

如图 4A 所示，在整个 100 纳秒的模拟过程中，野生型 SOX 和 SOX-EAAK-CBM3 的均方根偏差（RMSD）分别保持在约 1.0 埃和 5.0 埃，而 CBM3-XP-SOX 的均方根偏差则在 4.0 至 12 埃之间大幅波动，这表明在 N 端融合 CBM3 打乱了局部氢键网络，导致结构柔韧性增加。此外，还进行了均方根波动（RMSF）分析，以比较局部残基的动态变化。

图 4. 基于分子动力学（MD）模拟的 SOX 变体分析。融合 SOX 变体的稳定性评估及 AlphaFold3 预测的连接子结构轮廓。（A）SOX 变体的均方根偏差（RMSD）曲线：野生型、CBM3-XP-SOX 和 SOX-EAAK-CBM3；（B）SOX 变体的均方根波动（RMSF）曲线：野生型、CBM3-XP-SOX 和 SOX-EAAK-CBM3；（C-E）野生型 SOX（C）、CBM3-XP-SOX（D）和 SOX-EAAK-CBM3（E）的吉布斯自由能景观曲线。（F1-G1）在室温下孵育 7 天后融合 SOX 变体结构完整性的 SDS-PAGE 分析（F1：CBM3-XP-SOX；G1：SOX-EAAK-CBM3）；（F2-G2）融合 SOX 变体中连接子的 AlphaFold3 预测结构轮廓（F2：CBM3-XP-SOX；G2：SOX-EAAK-CBM3）。

融合 SOXs 和野生型 SOX 的柔韧性（图 4B），与均方根偏差（RMSD）分析结果一致，野生型 SOX 和 SOX-EAAK-CBM3 的均方根波动（RMSF）值较低（1 - 2 Å），而 CBM3-XP-SOX 在 150 - 156 残基段的 RMSF 值较高，该段对应一个刚性基序，包含 K、E 和 P 残基，其中脯氨酸占主导。由于脯氨酸的环状侧链缺乏酰胺键，无法与相邻残基形成氢键，因此该富含脯氨酸的区域柔韧性降低[40]。在定向固定化过程中，CBM3 介导的与纤维素的结合对连接子施加了相当大的机械应力，这需要有效的结构域分离以及足够的韧性以实现水分散[41]。CBM3-XP-SOX 连接子韧性不足可能是其在固定化过程中发生断裂的原因。

CBM3 与 SOX 之间的跨域连接子是需要高机械耐受性的关键柔性区域。将 GROMACS 模拟数据与 AlphaFold3 结构预测相结合表明，C 端融合体（SOX-EAAK-CBM3）在其连接子区域内的均方根波动（RMSF）极小。值得注意的是，如文献[39]所述，残基 384 - 386 形成的α-螺旋结构增强了连接子的韧性。相应地，SOX-EAAK-CBM3 在 100 纳秒内表现出极小的均方根偏差（RMSD）变化，证实了其相较于 N 端变体具有更出色的构象稳定性。这些发现突显了连接子拓扑结构和二级结构在定向固定化过程中维持功能稳定性的重要性。在分析过程中，排除了辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）对蛋白质力场的潜在影响。为了进一步验证这一点，对 SOX 变体进行了两种条件下的分子动力学（MD）模拟：有 FAD 和无 FAD（图 S6A - C）。结果表明，FAD 对 SOX 变体的局部残基波动（由 RMSF 反映）或整体构象偏差均无显著影响。

图 4 展示了三种酶构建体的自由能景观（FEL），其中吉布斯自由能（ΔG）与前两个主成分（PC1 和 PC2）的关系。FEL 以颜色梯度表示：蓝色表示热力学稳定（低能）构象，红色表示不太稳定（高能）状态[26]。系统分析表明，野生型 SOX 的 Δ_G 分布相对集中（图 4C）。相比之下，将 CBM3 融合到 SOX 的 N 端导致 Δ_G 分布明显分散，且 PC1/PC2 值显著高于野生型和 C 端融合（图 4D 和 4E）。综上所述，这些观察结果表明，CBM3 的 N 端融合损害了融合酶的整体结构稳定性，这与反映其构象灵活性增加的较高均方根偏差（RMSD）和均方根波动（RMSF）值一致。

为了进一步验证 CBM3 融合 SOX 构建体的稳定性，将 CBM3-XP-SOX 和 SOX-EAAK-CBM3 在环境温度下连续孵育 7 天，每天取样进行 SDS-PAGE 分析。如图 4F1 所示，CBM3-XP-SOX 的电泳图谱显示出一条与野生型 SOX 分子量相对应的清晰蛋白条带。值得注意的是，在整个孵育期间，该条带的强度随时间增加而增强。然而，对于 SOX-EAAK-CBM3 并未检测到任何裂解片段（图 4G1）。这些观察结果与我们在图 2B、C 中描述的 SOX-纤维素结合试验结果一致。总体而言，这些发现表明 SOX 从纤维素上的脱落是由于连接子的裂解。进一步支持这些结论的是图 2H 和 I 中呈现的 SEM 分析结果。在这些实验中，将 CBM3-XP-SOX 和 SOX-EAAK-CBM3 以等量的酶浓度加载到纤维素膜上，然后在去离子水中过夜孵育。在这些相同的条件下，CBM3-XP-SOX 在膜表面的滞留量极小，而 SOX-EAAK-CBM3 则对纤维素基质保持着很强的结合亲和力。

通过差示扫描量热法（DSF）评估了所有蛋白变体在自由溶液中的热稳定性，以测试 CBM3 融合的内在结构效应（图 S7A-D）。结果表明，野生型 SOX（图 S7A）显示出一个单一的对称熔解峰（Tm ~ 43.47℃），对应于天然结构域的变性，而 SOX-EAAK-CBM3（图 S7C）则表现出一个清晰的对称峰，其熔解温度显著升高（~46.98℃，升高 3.51℃）——这是 CBM3 通过 EAAK 连接子融合对 SOX 进行内在结构稳定化的直接指标，该连接子可最大程度地减少结构域间的空间位阻，使 CBM3 能够作为结构伴侣发挥作用，与 SOX 形成非共价的分子内相互作用，从而使其三级结构更加刚性，并减少溶液中导致变性的构象灵活性。这种对 SOX 的内在结构稳定化是其在纤维素上固定化后具有卓越长期稳定性（25 天）的关键分子基础。与此形成鲜明对比的是，CBM3-XP-SOX（图 S7B）在三次 DSF 重复实验中表现出显著的重现性差，峰形不一致，熔解转变强度变化，且有轻微的 T_m 移动；它具有不规则的多峰轮廓（在约 58.3℃、60.61℃、68.73℃、77.6℃ 有熔解转变，以及在 90℃ 以上有一个额外的峰），这是由于在 CBM3 和 SOX 之间非特异性和异质性的 XP 连接子裂解所致。在不同重复实验和单个样本内部，连接子裂解情况各不相同，从而产生了完整的融合蛋白、游离结构域和裂解片段的异质混合物，这直接导致了差示扫描量热法（DSF）重现性差，因为裂解片段在不同实验中的变性温度和强度各不相同，从而导致了协同变性。

图 S7. 利用差示扫描荧光法（DSF）评估蛋白质变体的热稳定性。（A-D）分别为野生型 SOX、CBM3-XP-SOX、SOX-EAAK-CBM3 和 CBM3-XG-SOX 的DSF热稳定性曲线。

总体而言，通过分子动力学模拟、SDS-PAGE 和差示扫描量热法（DSF）分析，初步将 CBM3 融合到 SOX N 端时连接区的不稳定性归因于 XP 刚性连接子基序，其韧性不足使其在生理压力下易于断裂。相比之下，C 端融合连接子采用了包含 EAAK 基序的α-螺旋构象——这一结构特征在保持固有刚性的同时增强了连接子的韧性。这一综合分析表明，连接子的拓扑结构和二级结构对 CBM3-SOX 融合体的功能稳定性有显著影响，含 EAAK 的α-螺旋连接子提供了最佳的机械耐受性以维持结构域的连接（图 4F2、G2）。

3.6. CBM3-XP-SOX 链接子的优化

为解决与 CBM3-XP-SOX 构建体相关的连接子不稳定问题，我们采用了结构导向的连接子工程策略。我们使用 gmx_RRCS 这一计算分析工具，通过距离波动分析来量化残基间的相互作用强度，系统地评估了连接子中各个残基与 CBM3-XP-SOX 架构中所有其他氨基酸的相互作用倾向[27]。我们的分析发现，有三个残基——赖氨酸（K）、谷氨酸（E）和脯氨酸（P）——表现出比其他连接子成分显著增强的相互作用倾向（图 S8A-C）。

鉴于 K（等电点 pI = 9.6）的基本性质和 E（pI = 3.15）的酸性，我们将连接脯氨酸的 K-E-P 基序截断，以实现连接区的电荷平衡[42]。结合连接区长度的优化，这一修改暴露了灵活的甘氨酸（Gly）残基，随后将其直接与 SOX 相连，以增强连接区的整体韧性[43,44]。由此产生的工程变体被命名为 CBM3-XG-SOX。基于原始的 RRCS 值，我们重新计算了 RRCS，以评估两个残基对（E-P 和 W-G）之间的相互作用。结果表明，E-P 残基对的 RRCS 值有显著波动，RRCS 值高于 1.0，表明这两个残基之间存在强相互作用。相反，W-G 残基对的 RRCS 值为零，这表明这两个特定残基之间不存在相互作用。这种定量比较提供了直接的数值证据，表明甘氨酸替代有效地减少了导致裂解的结构约束（图 S8D）。

鉴于完全截断会同时改变连接子的长度、组成和柔韧性，从而使得对各个影响因素的分解变得复杂，我们对连接子进行了定点突变。在连接区设计了三个氨基酸残基（K、E 和 P），旨在保持原始连接区长度的同时，利用 LigandMPNN 打破已识别的不稳定相互作用。随后，使用 FoldX 计算所得突变体的折叠自由能（ΔG）。如图 S6D 所示，在所有计算生成的突变体中，只有 V-E-P 变体的 Δ_G（-90.05 kJ/mol）低于原始的 K-E-P 连接区（-86.43 kJ/mol）。其他有前景的候选体，如 A-E-G（-84.50 kJ/mol）和 E-E-A（-85.15 kJ/mol），其折叠自由能与亲本序列相当或略高，表明这些特定替换的稳定作用很小。随后，我们对表现最佳的点突变体（V-E-P、A-E-G、E-E-A）以及完全截断的 XG 变体进行了 100 纳秒的分子动力学（MD）模拟，以评估其结构稳定性。RMSD 曲线（图 S6E）显示，E-E-A 突变体的整体结构偏差最大，表明其稳定性较差。尽管 V-E-P 和 A-E-G 突变体的均方根偏差（RMSD）曲线相较于 E-E-A 突变体有所改善，但它们的偏差值仍明显高于 XG 变体（完全截断），在整个模拟过程中，XG 变体保持了最稳定的均方根偏差轨迹。详细的均方根波动（RMSF）分析（图 S6F）证实，尽管在 A-E-G 突变体中引入了灵活的甘氨酸残基，但所有点突变体的连接区波动仍显著高于 XG 变体。从均方根波动图中观察到的连接区持续高灵活性表明，这些点突变均不足以达到截断构建体所具有的结构刚性水平。

3.7. 验证优化后的 N 端连接子 CBM3-XG-SOX 的结构稳定性

鉴于 XG 变体（完全截断连接子）的结构稳定性优于所有点突变体，随后对 N 端连接子优化后的 CBM3-XG-SOX 进行了进一步的结构稳定性验证，以确认其稳定性优势。对 CBM3-XG-SOX 进行的 FEL 分析显示，其 ΔG 分布明显窄于 CBM3-XP-SOX（图 5A）。此外，PC1 和 PC2 的值相对于优化前的亲本构建体显著降低。综上所述，这些发现表明工程化的 CBM3-XG-SOX 变体实现了整体结构稳定性的提升。

CBM3-XG-SOX 变体经过异源表达、纯化，并对其酶学特性进行了全面表征（图 5C、D）。主要发现总结如下：最适温度范围为 20 - 30℃（环境温度），催化活性较野生型 SOX 提高了 45.58 - 52.61%；温度稳定性分析显示，在 20 - 50℃时残余活性为 81.44 - 87.79%；最适 pH 值为 8，pH 稳定性在 pH 7 时达到峰值（残余活性为 85.49%），在 pH 值低于 7 或高于 8 时显著下降。这些结果表明，CBM3-XG-SOX 变体在环境温度下保持了增强的活性，同时 pH 相关特性未变，使其非常适合用于基于传感器的应用。

此后，通过扫描电子显微镜成像、纤维素结合试验和电化学阻抗谱测量相结合的方法来验证成功实现了功能固定化。如扫描电子显微镜成像（图 5E）所示，在纤维素膜上观察到了明显的 SOX 聚集，这证实了它们之间结合的牢固性。随后，SDS-PAGE 分析表明，CBM3-XG-SOX 显示出快速的纤维素结合动力学，在 5 分钟内几乎完全结合（效率为 91.56%）（图 5F）。电化学阻抗谱测量进一步证实了固定化成功，CBM3-XG-SOX 修饰电极的电荷转移电阻（Rct = 186.6 Ω）明显高于未添加酶的对照电极（仅纤维素，Rct = 175 Ω）（图 S2C）。

最终，对优化后的 CBM3-XG-SOX 进行了表达和纯化，并进行了为期 7 天的稳定性测试（图 5G）。结果表明，该工程化的 CBM3-XG-SOX 保持了结构完整性，在整个测试期间均可检测到裂纹没有出现任何变化。

3.8. CBM3-XG-SOX 改性生物传感器的电化学性能

电化学评估结果表明，在不同浓度的肌氨酸添加下，在 _+0.6 V 处观察到了氧化峰的浓度依赖性梯度响应（图 S2D）。值得注意的是，优化后的 SOX 生物传感器的电化学稳定性显著提高，从 2 天（对于 CBM3-XP-SOX）延长至 15 天（图 5H1、H2）。在此期间，传感器对肌氨酸在 25–175 _μM 范围内保持了出色的电流响应线性关系（R2 > 0.99），回归方程为 y ₌ 9.418 _×10−11x ₊ 6.8 _×10−10，灵敏度为 1332.9 _μA.mol−1.L.cm−2，检测限为 15.87 _μM（S/N ₌ 3）。在本研究中，通过合理设计连接子，成功构建了 N 端 CBM3-SOX 融合蛋白。其电化学稳定性从原来的 2 天提高到 15 天，提高了 7 倍以上，同时保持了高灵敏度和检测性能。这些发现表明，连接子设计在优化用于生物传感应用的融合蛋白稳定性方面起着关键作用。

所开发的 CBM3-XG-SOX/纤维素/Pt 和 SOX-EAAK-SOX/纤维素/Pt 生物传感器的分析性能与先前报道的电化学 SOX 生物传感器进行了比较（表 1）。其线性范围和检测限（LOD）与大多数文献报道的电化学电极相当，足以检测健康样本和稀释的高肌酐血症样本中的肌酐。值得注意的是，通过在室温下重复分析连续注射线性范围来评估该生物传感器的可重复使用性，其表现优于大多数先前报道的在不使用时需在 4℃下保存的生物传感器。

3.9. CBM3-XG-SOX 改性生物传感器的抗干扰测定、回收率测定及实际样品检测

为消除溶液混合造成的干扰，将 100 μM 硫辛酸和干扰物质[7 mM 葡萄糖（Glu）、2 mM 尿素、0.2 mM 尿酸（UA）、50 μM 抗坏血酸（AA）、140 μM 肌酐（Cre）和 80 _μM 肌酸（CR）；不含硫辛酸]分别注入 SOX 生物传感器。如图 S1B 所示，基线噪声（红线）定义为瞬态响应后长时间内的均方根（RMS）电流波动，平均 RMS 噪声为 0.99 nA，最大峰值噪声 <_1.5 nA，远低于硫辛酸响应电流（20 nA）。使用标准公式 SNR ₌ 稳态响应电流 _÷baseline RMS 噪声，计算得出硫辛酸的 SNR 超过 12（15.25），远高于 SNR ≥ 3 的阈值，表明信号可靠。黑线证实了 SOX 修饰生物传感器的高特异性，对常见干扰物的响应可忽略不计（图 S1B）。

在标准实验条件下，模拟并添加了上述干扰物，其浓度相当于人体血清中正常或超生理水平，以进一步评估其对生物传感器的干扰作用（图 6A、B）[30]。干扰率分别为 3.58%、4.66%、14.47%、2.02%、5.33% 和 6.64%。除尿酸对 SOX 生物传感器有一定干扰外，其他干扰物的影响可忽略不计。此外，在实际样本检测过程中，我们采用了差分测量法（从反应后信号中减去基线信号），从而消除了血清和尿液中存在的干扰物。因此，实际检测中唯一具有显著影响的因素是肌酐和肌酸分别经肌酐酶和肌酸氨甲酰水解酶不完全水解后对 SOX 生物传感元件产生的反馈抑制作用。为了进一步有效降低尿酸的干扰，向（100 μL 体积）原始酶膜系统中添加了 0.5 μL 的 5 wt% Nafion 溶液。

图 5. 优化后的 CBM3-XG-SOX 的多维表征。（A）CBM3-XG-SOX 的吉布斯自由能景观图；（B）由 AlphaFold3 预测的 CBM3-XG-SOX 连接子结构图；（C1-D1）工程化 CBM3-XG-SOX 与野生型 SOX 的最佳温度（C1）和 pH 值（D1）的比较分析图；（C2-D2）CBM3-XG-SOX 的热稳定性（C2）和 pH 稳定性（D2）图；（E）负载 CBM3-XG-SOX 的纤维素膜的扫描电子显微镜图像；（F）证实 CBM3-XG-SOX 与纤维素膜结合的 SDS-PAGE 验证结果；（G）CBM3-XG-SOX 结构完整性的 SDS-PAGE 评估；（H1-H2）CBM3-XG-SOX 的安培（i-t）响应曲线（H1）以及基于肌氨酸诱导的电流变化（ΔI，H2）计算得出的线性校准曲线。 

随后，测定了生物传感元件的回收率（R）：将肌酐浓度为 45.2 μM（C1）的血清样本以梯度浓度（200、400、600、800、1000 μM；C₂)等体积）加入肌酐，然后检测加标血清样本（C3），并按以下公式计算回收率：

如表 4 所示，计算得出的回收率在 96.28% 至 97.88% 之间。对实际样本的检测充分证明了该 SOX 生物传感器具有高测定精度、宽检测范围、快速响应速度和相对稳定性，从而证明其在临床诊断中的可行性。

4. 结论

本研究通过合理的基因设计和生物信息学指导优化，系统地构建了 CBM3 融合 SOX 变体，以开发用于肌酐检测的高性能生物传感元件。通过研究融合位点、连接子拓扑结构和结构稳定性对酶活性、固定化效率和电化学性能的影响，我们建立了一个稳健的框架，用于工程化融合酶以适应生物传感器应用。

将 CBM3 通过一个α-螺旋 EAAK 连接子融合到 SOX 的 C 端（SOX-EAAK-CBM3）产生了更优的可溶性表达（15.96 毫克/毫升），增强了常温催化活性（比野生型 SOX 高 39.96% - 56.23%），并且具有出色的电化学稳定性（25 天，R² > 0.99）。相比之下，通过富含脯氨酸的 XP 连接子在 N 端融合（CBM3-XP-SOX）由于连接子的断裂导致结构不稳定，这从 SDS-PAGE 分析、分子动力学模拟以及电化学稳定性降低（仅 2 天）中得到了证实。为了解决这一局限性，通过结构指导对 CBM3-XP-SOX 进行连接子工程改造——截断不稳定的 K-E-P 基序并引入灵活的甘氨酸残基形成 CBM3-XG-SOX 变体——显著提高了结构完整性。优化后的 N 端融合构建体表现出减少的构象波动（分子动力学模拟中较低的均方根偏差和均方根波动值）、持续的酶活性以及延长的电化学稳定性（15 天），与亲本 CBM3-XP-SOX 相比，稳定性提高了 7 倍_以上。

CBM3 介导的在纤维素膜上的定向固定使底物接触更高效，电化学响应速度更快（19 至 30 秒），与传统的戊二醛交联（78 至 81 秒）相比优势明显。CBM3-XG-SOX/纤维素/Pt 生物传感器对肌氨酸（25 至 175 _μM)）表现出线性响应，相关系数（R2）为 0.99，灵敏度为 1332.9 _μA.mol⁻1.L.cm⁻2，检测限（LOD）为 15.87 μM。值得注意的是，该生物传感器对生理干扰物（如葡萄糖、尿素、抗坏血酸）具有很强的抗干扰能力，在实际样本（血清和尿液）分析中表现出卓越的准确性，回收率为 96.28% 至 97.88%，与市售肌酐检测试剂盒相比无显著差异（p > 0.05）。对于低肌酐血清样本和高肌酐尿液样本，该生物传感器的测量误差范围（分别为 4.49% 至 10.43% 和 0.445% 至 1.901%）比市售试剂盒更窄，突显了其临床应用价值。

总之，这项工作强调了连接子设计和融合位点选择在优化 CBM 融合酶的结构稳定性和功能表现方面所起的关键作用。将 AlphaFold3 用于结构预测以及 GROMACS 用于分子动力学模拟，为结构域相互作用和连接子动态提供了宝贵的见解，从而加快了理性工程进程。所开发的 CBM3 融合 SOX 生物传感器为即时检测肌酐提供了一种有前景的替代方案，具有响应迅速、灵敏度高、长期稳定和成本效益高的特点。未来的研究方向可能包括进一步优化连接序列、探索其他 CBM 家族以及将生物传感元件集成到微型设备中，以促进临床转化和家庭应用。

图 6. 基于 CBM3-XG-SOX 的生物传感元件的抗干扰性能评估及实际样本分析。（A-B）在模拟人血清中评估基于 CBM3-XG-SOX 的生物传感元件对常见血清干扰物（包括葡萄糖、尿素、尿酸、抗坏血酸、肌酐和肌酸）的抗干扰能力；（C-D）在 CBM3-XG-SOX 生物传感元件表面修饰一层薄的 Nafion 膜，重新评估其对上述血清干扰物的抗干扰能力；（E）基于 CBM3-XG-SOX 的生物传感器在人血清或尿液样本中检测肌酐的机制示意图。

表 2 采用不同方法测定人血清中的肌酐。

肌酐：肌酐（Cre）

表 3 采用不同方法测定人尿中的肌酐。

肌酐：肌酐。

表 4 采用 CBM3-XG-SOX 改性生物传感器测定人血清中肌酐的回收率。