应用案例：蛋白稳定性分析仪PSA-16助力融合酶生物传感器的开发

蛋白稳定性分析仪PSA-16（北京佰司特科技有限责任公司）助力助力齐鲁工业大学（山东省科学院）生物研究所、山东省生物传感与微生物智能代谢调控重点实验室、山东大学齐鲁医学院国家药品监督管理局药物制剂技术研究与评价重点实验室的科研人员开发快速、灵敏、稳定的即时检测（POCT）肌氨酸氧化酶（SOX）生物传感器，并于2026年3月在《International Journal of Biological Macromolecules》期刊发表了题为“The role of linker on the elevated biosensing performance of a carbohydrate-binding module-tagged sarcosine oxidase”的研究论文。

为评估融合了 CBM3 的 SOXs 的结构稳定性，将酶溶液稀释至最终浓度为 1 毫克/毫升，置于 PBS 缓冲液（pH 值 8.0）中，在室温下孵育 7 天。每天定时取样，随后进行 SDS-PAGE 分析。

使用北京佰司特科技有限责任公司生产的 PSA-16 型仪器对目标蛋白的热稳定性进行了评估。首先将样品稀释至 1 毫克/毫升的浓度。然后，将 20 微升稀释后的样品置于石英玻璃管（产品编号162301CP，同样由北京佰司特科技有限责任公司生产）中。采用线性温度扫描法，测量 330nm和 350nm处的内源性蛋白质荧光强度。温度范围为 30 至 90 摄氏度，升温速率为 1 摄氏度/分钟。根据 F350/F330 曲线的斜率计算热变性中点温度（Tm）。每个样品均进行了 3 次测量。

摘要

肌酐是评估肾功能的关键生物标志物，开发其快速、灵敏、稳定的即时检测（POCT）生物传感器至关重要。基于酶的生物传感器使用肌氨酸氧化酶（SOX）在三酶级联反应中颇具前景，但在固定化后的酶活性和长期稳定性方面仍存在挑战，尤其是对于活性较低的 SOX。在此，我们报告了对糖结合模块 3（CBM3）融合 SOX 变体的合理工程改造，以解决这些局限性。CBM3 通过不同的连接子（富含脯氨酸的 XP 连接到 N 端，α-螺旋 EAAK 连接到 C 端）与单体 SOX 基因融合，生成了 CBM3-XP-SOX 和 SOX-EAAK-CBM3。比较分析表明，SOX-EAAK-CBM3 表现出更优的可溶性表达（15.96 毫克/毫升）、增强的常温催化活性（比野生型 SOX 高 39.96% - 56.23%）以及出色的电化学稳定性（25 天，R2 > 0.99）。相比之下，CBM3-XP-SOX 遭受连接子裂解和结构不稳定，稳定性仅限于 2 天。对 N 端融合的结构指导连接子工程发现 XP 连接子中存在不稳定的 K-E-P 基序；通过截断和灵活引入甘氨酸，得到了 CBM3-XG-SOX。CBM3-XG-SOX/纤维素/铂生物传感器的电化学稳定性比亲本 CBM3-XP-SOX 提高了 7 倍（15 天），响应迅速（19 至 30 秒），对生理干扰物具有很强的抗干扰能力。血清和尿液实际样本分析证实，其准确度（回收率：96.28% - 97.88%）和精密度优于商业试剂盒，对于低或高肌酐浓度的误差更小。这项工作通过生物信息学指导的连接子/融合位点优化，为融合酶工程建立了一个合理的框架，克服了基于低活性酶的生物传感器的局限性。CBM3 融合 SOX 生物传感器能够实现经济、稳定、灵敏的即时检测肌酐，具有广泛的临床诊断和家庭健康监测应用。

在本研究中，通过端到端基因融合方法系统地构建了一系列 CBM 融合 SOX，以开发增强型生物传感元件。对影响融合酶稳定性的因素进行研究发现，N 端和 C 端连接区内的特定残基对 SOX 的结构完整性起着关键作用。在合理生物信息学分析的指导下，对这些不稳定残基进行了策略性截断，从而获得了稳定的融合酶。实验验证表明，这种优化显著提高了相应 SOX 基生物传感器的稳定性。这项工作建立了一个用于设计具有可调特性的融合酶的合理框架，为构建高性能生物传感器平台提供了一种稳健的策略。

 CBM3 融合 SOXs 的稳定性测定

为评估融合了 CBM3 的 SOXs 的结构稳定性，将酶溶液稀释至最终浓度为 1 毫克/毫升，置于 PBS 缓冲液（pH 值 8.0）中，在室温下孵育 7 天。每天定时取样，随后进行 SDS-PAGE 分析。

使用北京佰司特科技有限责任公司生产的 PSA-16 型仪器对目标蛋白的热稳定性进行了评估。首先将样品稀释至 1 毫克/毫升的浓度。然后，将 20 微升稀释后的样品置于石英玻璃管（产品编号162301CP，同样由北京佰司特科技有限责任公司生产）中。采用线性温度扫描法，测量 330nm和 350nm处的内源性蛋白质荧光强度。温度范围为 30 至 90 摄氏度，升温速率为 1 摄氏度/分钟。根据 F350/F330 曲线的斜率计算热变性中点温度（Tm）。每个样品均进行了 3 次测量。

通过差示扫描量热法（DSF）评估了所有蛋白变体在自由溶液中的热稳定性，以测试 CBM3 融合的内在结构效应（图 S7A-D）。结果表明，野生型 SOX（图 S7A）显示出一个单一的对称熔解峰（Tm ~ 43.47℃），对应于天然结构域的变性，而 SOX-EAAK-CBM3（图 S7C）则表现出一个清晰的对称峰，其熔解温度显著升高（~46.98℃，升高 3.51℃）——这是 CBM3 通过 EAAK 连接子融合对 SOX 进行内在结构稳定化的直接指标，该连接子可最大程度地减少结构域间的空间位阻，使 CBM3 能够作为结构伴侣发挥作用，与 SOX 形成非共价的分子内相互作用，从而使其三级结构更加刚性，并减少溶液中导致变性的构象灵活性。这种对 SOX 的内在结构稳定化是其在纤维素上固定化后具有卓越长期稳定性（25 天）的关键分子基础。与此形成鲜明对比的是，CBM3-XP-SOX（图 S7B）在三次 DSF 重复实验中表现出显著的重现性差，峰形不一致，熔解转变强度变化，且有轻微的 T_m 移动；它具有不规则的多峰轮廓（在约 58.3℃、60.61℃、68.73℃、77.6℃ 有熔解转变，以及在 90℃ 以上有一个额外的峰），这是由于在 CBM3 和 SOX 之间非特异性和异质性的 XP 连接子裂解所致。在不同重复实验和单个样本内部，连接子裂解情况各不相同，从而产生了完整的融合蛋白、游离结构域和裂解片段的异质混合物，这直接导致了差示扫描量热法（DSF）重现性差，因为裂解片段在不同实验中的变性温度和强度各不相同，从而导致了协同变性。

图 S7. 利用差示扫描荧光法（DSF）评估蛋白质变体的热稳定性。（A-D）分别为野生型 SOX、CBM3-XP-SOX、SOX-EAAK-CBM3 和 CBM3-XG-SOX 的DSF热稳定性曲线。

总体而言，通过分子动力学模拟、SDS-PAGE 和差示扫描量热法（DSF）分析，初步将 CBM3 融合到 SOX N 端时连接区的不稳定性归因于 XP 刚性连接子基序，其韧性不足使其在生理压力下易于断裂。相比之下，C 端融合连接子采用了包含 EAAK 基序的α-螺旋构象——这一结构特征在保持固有刚性的同时增强了连接子的韧性。这一综合分析表明，连接子的拓扑结构和二级结构对 CBM3-SOX 融合体的功能稳定性有显著影响，含 EAAK 的α-螺旋连接子提供了最佳的机械耐受性以维持结构域的连接（图 4F2、G2）。

本研究通过合理的基因设计和生物信息学指导优化，系统地构建了 CBM3 融合 SOX 变体，以开发用于肌酐检测的高性能生物传感元件。通过研究融合位点、连接子拓扑结构和结构稳定性对酶活性、固定化效率和电化学性能的影响，我们建立了一个稳健的框架，用于工程化融合酶以适应生物传感器应用。

总之，这项工作强调了连接子设计和融合位点选择在优化 CBM 融合酶的结构稳定性和功能表现方面所起的关键作用。将 AlphaFold3 用于结构预测以及 GROMACS 用于分子动力学模拟，为结构域相互作用和连接子动态提供了宝贵的见解，从而加快了理性工程进程。所开发的 CBM3 融合 SOX 生物传感器为即时检测肌酐提供了一种有前景的替代方案，具有响应迅速、灵敏度高、长期稳定和成本效益高的特点。未来的研究方向可能包括进一步优化连接序列、探索其他 CBM 家族以及将生物传感元件集成到微型设备中，以促进临床转化和家庭应用。

蛋白稳定性分析仪PSA-16

北京佰司特科技有限责任公司于2023年10月01日，推出了自主研发的第一款国产的基于内源差示扫描荧光技术（intrinsic fluorescence DSF）的蛋白稳定性分析仪（PSA-16），该设备性能和参数达到进口设备的水平，价格却远低于进口产品，弥补了目前国产自主设备在蛋白稳定性专业研究分析领域的空白。并于当年年底就成功安装了第一台设备到中牧股份兰州生物药厂。随后在2024-2025年又连续成功安装了多台到工业企业和科研单位，包括：上海近岸科技有限公司、郑州大学河南省医药科学研究院、吉林大学、辽宁大学、成都生物制品研究所有限责任公司、北京工商大学、石河子大学、北京友谊医院消化健康全国重点实验室、深圳技术大学、中国科学院深圳先进技术研究院、蓝星安迪苏南京有限公司、清华大学、成都中医药大学等，并获客户良好反馈。

北京佰司特科技有限责任公司积极服务客户，助力武汉大学、河南大学、齐鲁工业大学（山东省科学院）、中科院武汉病毒所、中国农业大学等单位合作发表多篇高质量论文（Nature子刊《npj Vaccines》、《International Journal of Biological Macromolecules》、《ACS Nano》、《Nucleic Acids Research》《Acta Crystallographica》等）。

2025年年初，北京佰司特科技有限责任公司成功出口第一台蛋白稳定性分析仪PSA-16到俄罗斯，2026年初又出口2台PSA-16到俄罗斯，开启国际市场的推广与销售。

主要参数

★ 测定参数：Tm、Cm、ΔG等；

★ 样品通量：16个；

★ 样品体积：≤20 uL；

★ 浓度范围：0.01-200 mg/ml；

★ 温控范围：15-110度；

★ 变温速度：0.1-15度/分钟；

★ Tm重复性：CV小于1%；

★ 耗材参数：一次性，无需清洗；

★ 八联排设计，适配多通道移液器；

蛋白稳定性分析仪PSA-16基于内源差示扫描荧光（ifDSF）技术，广泛应用于蛋白质稳定性研究、蛋白质类大分子药物（抗体）优化工程、蛋白质类疾病靶点的药物小分子筛选和结合力测定等领域，具有快速、准确、高通量等诸多优点。蛋白质中色氨酸/酪氨酸的荧光性质与它们所处的环境息息相关，因此可以通过检测蛋白内部色氨酸/酪氨酸在加热或者添加变性剂过程中的荧光变化，测定蛋白质的化学和热稳定性。

PSA-16采用紫外双波长检测技术，可精准测定蛋白质去折叠过程中色氨酸和酪氨酸荧光的变化，获得蛋白的Tm值和Cm值等数据；测定时无需额外添加染料，不受缓冲液条件的限制且测试的蛋白质样品浓度范围非常广（10 µg/ml - 250 mg/ml），因此可广泛用于去垢剂环境中的膜蛋白和高浓度抗体制剂的稳定性研究。此外，PSA-16具有非常高的数据采集速度，从而可提供超高分辨率的数据。同时PSA-16一次最多可同时测定16个样品，通量高；每个样品仅需要15 uL，样品用量少，非常适合进行高通量筛选。PSA-16操作简单，使用后无需清洗，几乎无维护成本。

蛋白稳定性分析仪PSA-16应用涵盖植物、生物学、动物科学、动物医学、微生物学、工业发酵、环境科学、农业基础、蛋白质工程等多学科领域。蛋白质是最终决定功能的生物分子，其参与和影响着整个生命活动过程。现代分子生物学、环境科学、动医动科、农业基础等多种学科研究的很多方向都涉及蛋白质功能研究，以及其下游的各种生物物理、生物化学方法分析，提供稳定的蛋白质样品是所有蛋白质研究的先决条件。因此多功能蛋白质稳定性分析系统在各学科的研究中都有基础性意义。

1.    抗体或疫苗制剂、酶制剂的高通量筛选

2.    抗体或疫苗、酶制剂的化学稳定性、长期稳定性评估、等温稳定性研究等

3.    生物仿制药相似性研究（Biosimilar Evaluation）

4.    抗体偶联药物（ADC）研究

5.    多结构域去折叠特性研究

6.    物理和化学条件强制降解研究

7.    蛋白质变复性研究（复性能力、复性动力学等）

8.    膜蛋白去垢剂筛选，膜蛋白结合配体筛选（Thermal Shift Assay）

9.    基于靶标的高通量小分子药物筛选（Thermal Shift Assay）

10.    蛋白纯化条件快速优化等

如果您对我们的产品感兴趣，欢迎联系我们预约技术交流和Demo测试。

北京佰司特科技有限责任公司 

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类器官串联芯片培养系统—HUMIMIC；类器官灌流式培养和代谢监测系统—IMOLA；

蛋白稳定性分析仪—PSA-16；单分子稳定性分析仪（磁镊力谱测量仪）—HiMT；单分子质量光度计—TwoMP；超高速视频级原子力显微镜—HS-AFM；微流控扩散测量仪—Fluidity One-M；

微纳加工点印仪—NLP2000/DPN5000；台式原子力显微镜—ACST-AFM；全自动半导体式细胞计数仪—SOL COUNT；农药残留定量检测仪—BST-100；