前沿进展:通过微生理方法解决药物分子预测难题—第四届大西洋毒理学研讨会报告(一)

前沿进展:通过微生理方法解决药物分子预测难题

—第四届大西洋毒理学研讨会报告(一)

Biology-inspired Microphysiological System Approaches to Solve the Prediction Dilemma of Substance Testing

t4 Workshop Report-跨大西洋毒理学智库的报告,该智库由Doerenkamp Zbinden基金会赞助,由巴尔的摩、康斯坦茨和乌得勒支的毒理学负责人合作完成。本文所表达的观点是作者本人的观点,不一定代表他们的工作机构的观点。

May 15, 2016

翻译和整理:北京佰司特贸易有限责任公司

 

最近出现的微生理系统——在体外模仿人体组织、器官和循环生物学的微流控仿生装置——被认为是可能彻底改变如今的药物开发模式。一项近期由美国政府倡议并在欧洲和亚洲开展的研究项目,最近获得了第一个前沿成果:基于微生理系统的人的单器官和多器官工程,在此基础上建立的测试系统有望模拟不同的疾病阶段,并在临床试验之前预测毒性、免疫原性、ADME谱和治疗效果。这一技术将对药物发展的未来产生重大影响。此外,基于微生理系统的分析可能会彻底改变我们当前的模式,对任何新物质(例如用于农业、食品、生态系统或化妆品)的危害进行排序,从而取代目前使用的实验动物模型。来自学术界、工业界和监管机构的36位专家在德国柏林举办了一个集中研讨会(2015年6月),回顾了目前微生理系统的现状,并评估了药物开发周期中广泛的、具有潜力的方法,提出了可行的技术解决方案,以实现人的体外生物学的下一个级别的技术。此外,会议重点介绍了器官芯片的重要的案例,以及各种国家和国际项目。最后,概述了未来的路线图,允许在全球范围内进行更具预测性和监管认可的物质检测的方法。

1. The prediction dilemma of substance testing using laboratory animals

使用实验动物进行药物开发的预测困境

根据欧洲委员会(EC)提交给理事会和欧洲议会(EC,2013d)的报告,2011年,欧盟(EU)成员国有1150万只动物被用于实验和其他科学目的。报告指出,用于人类医学、牙科和兽医学研究和开发的动物数量自2008年的上一份报告以来已从22.8%下降到18.8%。用于毒理学和其他安全性评价的动物数量占总数的8.75%,相对保持不变。然而,用于基础生物学研究的动物比例急剧上升,从38%上升到46%。到目前为止,这三个领域在欧盟用于科学目的的动物数量最多(2011年为870万)(Daneshianetal.,2015)。利用动物进行的药物分子的生物学研究所获得的信息是制药业和生物技术新药物发展的基础。欧盟报告强调了这一事实,眼研究,骨代谢,生育能力研究,效能测试,免疫原性测试,神经学和免疫学的研究领域,肿瘤的病理生理机制研究,用于疾病治疗目的获得药物作用机制等等是基础生物学研究需求增加的主要原因。但是,过去几十年的研究和发展已经清楚地表明,来自动物研究的数据往往不能很好地反映人类的状况(HackamandRedelmeier,2006;LeistandHartung,2013;Matthews,2008;Olsonetal.,2000;Pereletal.,2007;HartungandLeist,2008;Schnerchetal.,2010;Senaetal.,2010;Seoketal.,2013;vanderWorpetal.,2010;Hartung,2013)。这个结论可以从药物在临床试验中的反复失败中看出。某阶段临床试验候选成功率的行业基准分别为:一期48-64%,二期29-32%,三期60-67%(Cooketal.,2014;Hayetal.,2014)。因此,这里提出的报告侧重于药物测试难题的药物开发方面。新药开发目前面临两大障碍(Rovidaetal.,2015a):目前的药物开发方法在临床试验之前甚至在临床试验期间都有很高的候选药物消耗,不断增加的有关临床前测试的监管要求下,为避免对人体的伤害导致的研发效率降低(Fig.1)。过去七年的数据标明药物开发成本的显著增加(美国医药研究与制造商协会,PhRMA),而美国食品和药物管理局(FDA)新药批准率波动是由于灾害相关药物开发而引起的。研发生产率已经下降了超过15倍,通胀调整后的平均支出分别从20世纪70年代的每一种成功药物(包括失败的成本)的1.79亿美元增加到21世纪的26亿美元(Scannelletal.,2012;TuftsCSDD,2014)(Fig.1)。

图1:过去70年药物开发的变化(FDA, 2014a)对应美国药品研究和制造商(PhRMA, 2015)成员的药品研发支出。(减轻)-药物或物质失效,对人类有不利后果(见表1)(括号)-开发一种新药的平均成本,包括相应十年的失效成本 。

表1:药物对人体的不良影响的主要例子  

20世纪50年代和60年代的Thalidomide是第一个臭名昭著的药物失败案例,导致超过10000人出现极端残疾。这一事件引出了临床前致畸试验。随后的每一场失败都促使有关物质危害识别、安全测试和有效性评估的规定的增加。其中一些事件,包括最近2016年Bial-Portela&Ca.SA的脂肪酸酰胺羟化酶抑制剂失败,总结在Table1。这些历史上药物严重失败的结果都会引发一个经过几年的实验而确定的开发方法,涉及动物体外测试和健康志愿者或病人测试(Fig.2)。通常10000多个药物的开发通过一系列检测流程,最后才能获得一个成功的产品(KesselandFrank,2007)。传统上规定步骤形成的严格制度应用于这一过程,而复杂的测试过程的目标是为了确保患者的安全,这也是迄今为止最好的办法。然而,它常常是低效的,而且在今天,它可能会导致像Aspirin或Paracetamol这样的大获成功的药物无法获得监管部门的批准(Hartung,2009)。

图2:物开发周期:测试通量和成本概况垂直轴表示执行的测试的大致数量(灰色)和相关支出(蓝色)。 横轴表示以年为单位的开发时间(Paul et al., 2010)。 动物试验用于早期发现的机制作用模式研究,以及临床前阶段的毒性和ADME分析,而传统的体外试验主要用于靶标验证、靶标-侯选武的转化和候选物优化步。  

药物开发周期的投资的一小部分被用于发现和优化先导物(Pauletal.,2010),每次进行大量的体外试验来鉴定先导物,并且每个目标或先导物都需要进行大量的实验动物测试。尽管做出了这些努力,但实验动物与人类之间的进化距离以及目前人体体外试验与人体之间的差异并没有将临床试验中的成功率提高到令人满意的水平。虽然动物是系统的有机体,但它们不是人,对人体细胞的体外试验既不是生理的,也不是系统的。尽管在许多一期试验中进行了密集的临床前安全测试,但出现的安全问题可能会导致项目终止(Cooketal.,2014;Schusteretal.,2005)。临床前阶段无法预测疗效和毒性的会导致药物的发严重的延迟,测试低效的物质,甚至不必要的副作用以及启动不成功的和昂贵的临床项目,这是药物开发过程最大的投资点(Ledford,2011)。
除了制药行业的预测困境之外,类似的障碍也存在于其他行业,如化学和消费品行业,动物被用于物质的毒理学危害测试和风险评估。这种情况导致了对使用大量实验动物的伦理关注,这就需要对预测价值进行论证。

基于以上,很明显需要新的方法来填补评估所需要的缺口,并最终有助于提高药物开发的效率。我们相信,仿生的微生理体外系统(MPS)将成为这一桥梁的基石。
 

2. Microphysiological systems – an expanding toolbox for hazard, safety, disease and efficacy prediction of particulate matter, chemicals and drug candidates

微生理系统-用于微粒物、化学品和候选药物的危害、安全、疾病和效能预测的工具箱

2.1定义和术语

Microphysiological系统是微流体装置能够模拟人类(或任何其他动物物种”)体外生物学在生物可接受的最小的规模,定义为目的。流体流动(动态)应用于组织的生理营养以及微环境生物分子梯度和相关机械线索(如剪切应力)的创建是这些系统的一个主要方面,将它们与传统(静态)细胞和组织培养区分开来。

MPS的“系统”组件是指在体外设备内支持类似人体的组织和器官等效生理的设备。这可能包括物理因素的维持,如温度(如37°C)、相关pH值、所需氧气和湿度的供应和控制。此外,它包括机械耦合的器官通过模仿,例如,流动的血液,尿液,空气在肺、胆汁、胰液或脑流体,剪切应力关于血液和淋巴管,身体骨骼和软骨的压力,压力皮肤、肺和胃,肠蠕动运动和肌肉收缩。关于微流体工具如何用于力学生物学研究的更多细节,我们参考一篇综合综述(Polacheck等人,2013年)。此外,术语“系统”可能包括神经元和心脏组织的电活动读出。相关致动器和传感器的小型化实现使器件具备了在体内类组织特异性机电-生化信号的必要特征。它们支持扩张和压缩力,特别是与肺、骨和软骨相关的,以及用于电刺激和肌肉组织读出的微电极(Ahadian等人,2012;Dvir等人,2012)或刺激心肌细胞或神经元(Bussek等人,2009;Gramowski等人,2011;Himmel等,2012;Johnstone等人,2010,Khoshfetrat-Pakazad,2014)。此外,这种设备还可以应用其他的测量和控制技术手段,如无创光学成像。最后,MPS中的“系统”意味着高度自动化,这使得它健壮和可伸缩。为了尽可能接近地模拟人类药物暴露,实现可重复的高通量重复物质暴露方案,有必要考虑所有这些因素。关于这些特征的进一步详细信息在其他地方进行了回顾(Andersson和vandenBerg,2004;Huh等人,2011年;Ingber和Whitesides,2012年;Kim等人,2007;ParkandShuler,2003;Wuetal.,2010)。MPS的“生理”成分代表了真正模仿人类生物学的雄心。在当前的文献中,“真正的体外模拟”人类生物学被描述在不同的方式,取决于作者的背景和先前的经验。尽可能地遵循人体器官结构的模拟,包括适当的细胞到细胞、细胞到基质、生化和机械信号传递,是我们定义“生理”的基础之一。“以玻璃和硅酮为基础的器件辅以聚合物、纺织品、陶瓷或生物基质实体,单独设计,以满足每个特定器官微环境的形状、表面图案、刚度和微结构方面的良好要求(GriffithandSwartz,2006;NelsonandGleghorn,2011;Pexton等,2011)。另一个基础是维持健康的长期器官内稳态。第三个基础是修复和再生受损或患病器官的能力。因此,后一个基础逻辑上引入MPS的一个病理生理维度。最后一个关键的基础是在芯片中模拟人类病变组织,这进一步引入了病理生理学维度。

MPS的“微”组件代表每一种应用的生物水平的可接受尺度的最小型化。这种微型化是由四个主要因素驱动的:在培养组织中模拟器官功能,在药物开发周期的不同阶段的测试通量,人体细胞和组织的最小使用量,以及成本考虑。将基于MPS的器官培养物缩放到类器官级别,如下所定义,这是该领域可能的策略之一。今天大家都知道,几乎所有的人体器官都由多个相同的、功能自主的结构单元组成,实现各自器官相关的功能。这些结构在特定器官内的增殖是自然的风险管理工具,以防止在部分器官损伤或身体大量器官疾病期间导致的机能完全丧失。关于进化,这一概念使器官的大小和形状能够很容易地根据特定物种的需要进行调整——例如,老鼠和人的肝脏——仍然使用几乎相同的总体规划来建立单一的功能性organoids(“类器官”)。

organoids(“类器官”)一词早在1876年就在生命科学中以不同的方式被使用(Bristowe,1876,p.73),它的意思是最小的功能器官或组织单位。对15个关键人体器官进行了器官类型学组织学的选择,这些组织学都具有相关的功能和高度可变的聚集几何结构(Marxetal.2012)。理想情况下,类器官对药物的反应代表了器官的反应。因此,一个单一的类器官应该在用于MPS上尽可能小尺寸上反映器官的功能。特定的功能可以在较小的规模上模拟,然而,疾病的出现和发展以及组织修复和再生过程的研究需要更多相同的类器官来代表MPS中的器官的反应。关于MPS的缩放方面,Yu等人(2015)开发了一种用于药理学应用的设计和操作的计算方法。Stokes等人(2015)讨论了基于生理学和药理学的平台缩放以及复杂MPS技术结果的体内外转化。这些不同的方面反映了当前科学界MPS的多样性。MPS器件分为两类:平板和芯片,如图3所示。

图3:左上图为MIMETAS OrganoPlate,用于3D灌注细胞培养,微量滴定模式,左中图为Wyss研究所开发的Lung-on-a-Chip,上端中心描绘的是由瑞士巴塞尔ETH设计的微量滴定板,微流控通道连接多个球体,中端底部展示的是由TissUse开发的四个器官系统的示意图,右方展示的是基于芯片的人体平台的示意图。(荷兰MIMETAS;美国Wyss研究所;瑞士ETH; 德国TissUse GmbH)  

平板通常基于ANSI/SLAS (SLAS, 2014)定义的微量滴度平板尺寸,并使用被动的重力微流控或主动的微流泵(Ebrahimkhani等人,2014)。无论是基于重力的还是基于微流道的平板,其优点是它们可以与标准液体处理设备(如机器人移液器)一起使用,并完全兼容自动显微镜和平板读数仪。显微镜载玻片大小和其他格式的芯片是由一个主动的微流控流操作的(使用外部或上部的微流泵)。这支持在生理血管内或间质下模拟剪切应力,长时间维持蛋白质的稳定性和氧梯度基础的微环境。通常,当需要模拟更复杂的组织架构时,通常使用单芯片方法;而当每个系统需要更多的数据点时,首选基于平板的方法。

另外,MPS可以分为三个不同的类型: 单器官系统、多器官系统和更复杂的系统(通常称为人类的“Body-on-a-chip”系统,见图3)。单器官系统平板或芯片模拟单一的组织或器官功能,旨在提高人类单一器官对于颗粒物、化学物或候选药物的毒性的早期预测性。这些组织或器官可以以二维(2D)、三维(3D)或复杂有机型:2D代表悬浮或单层细胞培养;3D涉及不同几何形状的多层培养,如椭球体、多层和不规则组织形成;复杂有机型与3D的不同之处是,通过捕捉尽可能多的体内结构的特征来获得适当的器官功能(Hartung, 2014)。单器官系统包括那些采用被动的重力微流控从标准细胞培养板到使用主动微流泵(板上或外部的)的平板和微流控芯片类型的方法。这些方法可以产生不同的流动轮廓、不同的液体与组织的比率和其他生理相关的特征。多器官系统模拟一个系统内两个或多个器官模型的系统交互作用,从他们的交互中产生有害结局路径(Adverse outcome pathway, AOP)和作用模式(mode of action,MOA)的数据。相比之下,人体芯片(或机体芯片)系统被设想为模拟能够模拟整个有机体功能的许多器官的生理相互作用。例如,美国国防高级研究计划署(DARPA)/美国国立卫生研究院(NIH)为MPS计划(Hartung和Zurlo, 2012年)设定了至少10个标准,以明确此类器官组合的技术的挑战,但是这个数字尚未由科学界和监管机构确定。

目前关于MPS的文献描述了不同的培养时间:短期培养持续数小时或数天,支持单次接触急性物质测试,而长期培养持续数周或数月,支持疾病建模和重复剂量物质接触。

2.2MPS的人类细胞供应

人体就是今天研究和工业中体外实验所用的人类细胞和组织的来源(图4)。历史上,在体外实验中,人类细胞系来源首选于成人捐助者(蓝色箭头,图4),由于无限的增殖潜力、相对稳定和长期保持的能力。人类第一个细胞系——HeLa——是早在1951年就从Henrietta Lacks的肿瘤中提取出来的,她是一位患有宫颈腺癌的女性患者。目前有数千种或多或少代表不同器官/组织细胞类型的人类细胞系,例如,患者来源的人类细胞系,如HepaRG,用于许多毒性试验,以及CaCo-2细胞系用于肠渗透性试验。随着对哺乳动物细胞基因工程知识的增加,越来越多的人类细胞系已被纳入工业和研究应用(Sandig和Jordan, 2007年)。现有成熟的人类细胞系是MPS细胞培养的常见来源。细胞系的缺点是由于永生化而丧失部分功能。这些细胞还表现出许多由于其癌症背景而不代表健康细胞的生理功能,以及无法形成复杂的异质组织结构。来自健康供体的用于毒性试验和不良结果途径分析的原代组织块和活组织切片,或来自患者的用于有效性试验或疾病建模的原代组织块和活组织切片,是最复杂的类体内人体组织来源。这些资源主要用于基础研究和组织工程。关于MPS的使用,需要对相应的微系统进行调整,以便将此类人体组织块和活组织检查直接整合到流体中。组织块的缺点是其有限的来源和可获得性。

图4:体外类器官培养的人类细胞来源

不同的人类细胞和组织来源的分化潜力对应他们出现在人类的生命周期:

灰色箭头,表明分化潜能的干细胞

红色箭头,说明了诱导多能性使用初级细胞

蓝色箭头,突出无限扩展潜力的永生细胞系  

另一种在体外生成人体组织结构的常见方法是重新组装或重建人体的类器官。因此,所有原发性组织和/或其必需的成体组织特异性干细胞均可从供体或患者处获得(图4)(Clevers and Bender, 2015, Rookmaaker et al., 2015, Sato and Clevers, 2015)。连续地,从组织中分离出单个细胞,在体外扩增和重组。这种重建的主要目标是人类皮肤、肺和肠的屏障器官:来自MatTek的表皮™,来自EpiSkin的EpiSkin™,来自epielix的epi气道™和MucilAir™,来自MatTek的epi肠,分别是主要的重建例子。关于上皮性皮肤、肺和肠道屏障的非动物模型的全面概述,请参阅Gordon等人(2015。为了将这些模型集成到MPS设备中,MPS设备需要适应各自重构模型的标准架构。优化的制造程序和标准化供体库支持这种重建的人体组织模型。缺点是有限的体系结构复杂性、短期稳定性和成本。

还有另外三种方法可以为MPS中的有机物工程提供必要的人体细胞来源,胚胎、胎儿和诱导多功能干细胞——但只有诱导多能干细胞(iPSC)与主要从成年供体细胞(红色箭头,图4)一种。自从2006年Takahashi和Yamanaka提出诱导多能干细胞技术以来, 从来自患者或健康的捐赠者中诱导多能干细胞已成为常见的实验流程(Takahashi and Yamanaka, 2006)。一些令人印象深刻的公司,如Axiogenesis, Axol, BioTalentum, Cellular Dynamics International, Pluriomics, Lonza, Takara Bio Europe AB, Viagene Biotech, iXCells Biotechnologies, Applied StemCell, Applied Biological Materials, Centre for Commercialization of Regenerative Medicine and Cedars-Sinai已经建立并且提供细胞重组和/或提供差异化服务。尽管细胞重组已经成为专业标准,产生了超过1500个低温保存和特征良好的iPSC系,但是分化为器官特异性的人类细胞仍然是一个巨大的挑战。请参见Bellin et al. (2012)进行全面的回顾。在过去的三年中,从诱导多能性开始,对分化方案的实验研究出现了前所未有的增长。在这里,我们列出了一些论文,基于mps的有机物工程和后续试验开发相关的不同的细胞类型:肝细胞(Szkolnicka et al ., 2014),心肌细胞(Burridge et al., 2014),小肠(Kauffman et al., 2013),神经元(Hoelting et al., 2013, Lippmann et al., 2014, Lancaster and Knoblich, 2014, Terrasso et al., 2015, Simão et al., 2016)、肺(Ghaedi et al ., 2013),胆囊(Kauffman et al., 2013),胰腺(Pagliuca et al., 2014),肾(Song et al., 2012),皮肤(Itoh et al., 2013),胆管(Ogawa et al., 2015),骨髓(Hynes et al., 2014),卵巢(Leng et al., 2015),和脉管系统(Patsch et al., 2015)。据我们所知,没有一个方法或程序被制药行业采用来做重复性评估的试验,但有有一些数据推测MPS可能能够根据各种类器官的生理环境,正确的驱动未分化的iPS细胞定向分化(Moreno et al, 2015)。

胚胎细胞很少用于人类成人组织的工程,但最近,来自胚胎组织的间充质干细胞可以分化为神经元系(Zhang etal ., 2011)和成骨细胞系(Zhang etal ., 2010)。胎儿细胞的主要优点是它们保留了其增殖能力,同时致力于分化到终点,并且在本质上不致畸。然而,它们的来源存在争议。

胚胎干细胞(ESC)是在受精后早期从人胚泡内细胞群中获得的。在过去的几十年里已经创造出来各种各样的人类胚胎干细胞系(Mummery 2011)。这些多能祖细胞有时缺乏在iPSC中可见的表观遗传修饰。因此,ESC可能为分化为任何人类有机体提供最广泛的前景。人类胚胎细胞或细胞系的缺点是他们的使用引起的畸胎瘤的道德问题,正如所示移植实验所示 (Lees et al., 2007, Leist et al., 2008)。

多能干细胞起源上面描述的用于人类胃的新创组装(McCracken et al ., 2011),脑(Lancaster et al., 2013),肾(Xia et al., 2014)和肺(Dye et al., 2015)在静态培养系统。利用MPS对此类人体类器官进行生理、机械和电刺激似乎是一种有用的方法,有助于它们进一步分化为体内功能类器官单元。Huch和Koo(2015)和Li等人(2014a)综述了基于多功能人类干细胞的类器官培养。

 

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创建时间:2021-07-15 09:37