应用案例：在芯片上实时监测类器官的代谢学参数

应用案例（灌流式细胞代谢分析仪-IMOLA）：在芯片上实时监测类器官的代谢学参数

A novel lab-on-a-chip platform for spheroid metabolism monitoring

一种用于监测3D球体细胞团的代谢参数的新型芯片系统

翻译整理：北京佰司特贸易有限责任公司

 

      基于传感器的细胞微生理监测系统是一种非侵入性，无标签的技术，对活细胞进行实时监控，既可以去除生化标签的影响，还可以极大地提高毒理学检测的可预测性。在这个体外诊断智能移动实验室（IMOLA-IVD系统）中进行细胞培养，生成三维球体细胞团，进行微生理测量。使用3D打印机，在单个生物芯片上微加工制造出3X3微孔阵列，维持之前培养的9个HepG2三维球体细胞团。球体上面和下面的整合层结构设计，允许微孔中球体与生物芯片传感器的液体触和，同时防止球体被培养基灌注清洗走。优化的球体培养方案，在球体的直径大约620μm时，转移到生物芯片。IMOLA-IVD平台的生物芯片整合了ON/OFF泵循环设置，优化微孔中球体的培养，间歇向球体灌注新鲜培养基，测定细胞外酸化速率（EAR）和耗氧速率（OUR）。在一个概念证明实验中，培养基灌注球体36h，然后加入含1%十二烷基硫酸钠（SDS），裂解细胞，作为阳性对照。这些微生理测量参数显示，在整个实验中细胞外酸化速率的重复性，表明了实时监测球体的代谢活动的能力。灌注36h后用SDS导致了EAR和OUR的迅速下降，信号从37mV/h（±5）到8mV/h（±8）从308mv/h（±21）到-2mv/h（±3）。这种IMOLA-IVD系统被证实了对维球体细胞团进行药物分析，作为一种自动化筛选的方法具有很大的潜力。

 

Keywords：Spheroid-on-chip；Organ-on-chip；Microphysiometry；Label-free sensing；Extracellular acidification；Cellular respiration

 

INTRODUCTION

新的药物分子研究涉及包括目标鉴定、药物发现、化合物合成、临床前研究和药物开发等多个步骤（Kang et al. 2008），接下来是临床试验，生产，以及产品周期管理。当成功鉴别出一个有效的药物成分作为候选药物，临床前试验包括在体外（即细胞培养）和在体内（即动物）ADMET（吸收、分布、代谢、排泄，毒性）进行表征在新物质进入临床试验之前（Rubin and Gilliland 2012）。特别是，近年来使用人类和动物细胞的研究更多的强调改进体外毒理学研究（Baras et al. 2012; Ale´pe´e et al. 2014; Astashkina and Grainger 2014）。而在体内的动物研究可以提供的器官系统的药物相互作用的信息，与人的临床实验结果和预测准确度的差异，导致了药物开发的空缺部分（Waring et al.2015）。这种空缺可能让有害的药物进入到昂贵的临床试验阶段（Marx et al. 2016）。

药物毒性是临床试验和上市批准药物失败的主要原因。十大制药公司的平均成功率从1991年到2000年的数据表明89%的药物通过了临床前测试，但是在临床测试中失败（Kola and Landis2004）。在药物开发过程中，建立早期体外模型，可以准确的复制体内信息，是非常关键的，可以防止未来由于毒性导致临床前试验和临床试验之间的不对应引发的失败。在研发初期进行体外毒理学分析，基于“早失败，低成本”，尽早分析潜在毒性（Wen and Yang 2008）。

二维培养模型是部分化学品的早期、高通量评估毒性的重要组成。然而，单独来看这些结果试验并不总是预测体内人体器官的反应（Matsusaki et al. 2014）。这是因为在细胞系永生中缺少器官的特性。初级细胞保留了更多的细胞特异性，已被利用于贴壁培养和悬浮培养。然而，分离过程会破坏细胞表面受体，并且不利于长期培养，使得悬浮培养物进行毒性研究不可行（Soldatow et al. 2013）。

为了在体外评估器官毒性，三维细胞团作为一种补充出现了，用于创建一个来模拟组织原生环境的模型（Edmondson et al. 2014）。例如，肝切片包括所有类型的肝细胞和基质细胞，可以很好的模拟毒性机制（Bale et al. 2014）。然而，因为它们的尺寸和几何形状的增加，限制了三维细胞团的使用。此外，样品获取的困难，将肝切片切成临床前需要的体积，导致了无法进行高通量筛选（Lee et al. 2005）。肝细胞放置在水凝胶支架层之间，，能保持肝脏的特异功能可扩展的替代方案（Wilkening et al. 2003），这种夹层培养物评估肝毒性的可行性也有局限性，由于扩散条件有限，导致获得氧气和营养的细胞数量有限。球体，一种无支架的材料基于自组装的模型是一种很有前途的模型，更适合于高通量的原型毒性测试（Mueller et al. 2014），并且，与单层培养相比，具有更高的细胞活力和解毒能力（Abu-Absi et al. 2002）。

由于这些原因，近年来，越来越多的人注意到球体细胞团的多种用途测试方案，（Mehta et al. 2012; Soldatow et al. 2013; Astashkina and Grainger 2014）已经成功地用于高通量应用（Kelm and Fussenegger 2004）和长期培养（Ramaiahgari et al. 2014）。大多数细胞形成球体依赖于细胞的自组装，使它成为一个简单和通用的方法，可以易于整合到各种实验方法中。由于这些优点，球体是能与Organ-on-a-Chip器官芯片平台很好整合的组织模型。器官芯片是利用微流体学和生物学的结合，用于模拟复杂的体内条件，有可能成为早期药物配方毒理学评估不可或缺的诊断工具（Huh et al. 2012）。

实时监测不仅可以用于基础研究，还有可能改变毒理学研究的方式，通过增加单一研究的数据的时间分辨率（Eklund et al. 2004）。传统毒理学评估的一大缺点是需要多个样品，以建立一个接触后的时间反应。这就增加了药物开发相关的成本。实时评估的优势是单一样品可提供长期数据，时间分辨方式。细胞微生理测量，一种无标记的技术，传感器芯片监测代谢参数，可用于间接和非侵入性监测3D模型的代谢过程，提供长期的毒性反应或动力学数据（Weltin et al. 2014）。此外，连续在线微生理测量系统的监测允许对化学刺激反应后细胞的恢复的研究，这一过程不容易通过传统方法进行探索（Wang et al. 2005）。最近，电化学传感器集成在一个96孔板中然后用于乳酸和氧的测量肝细胞球体（Weltin et al. 2017）。HepaRG细胞以接种密度培养2000个细胞/孔，在摇床上放置3天。抗霉素A是一种有氧代谢途径的抑制因子，Bosentan可以诱导急性肝毒性，抗霉素A和Bosentan的研究证明了能够监测接触药物之后新陈代谢的有害变化。

在本工作中，IMOLA-IVD模块化，电化学原理，使用实时细胞微生理测量代谢和形态的平台参数，如细胞外酸化度（pH）、细胞呼吸氧消耗量（pO2）和形态（阻抗），监测HepG2球体（Weiss et al. 2013年）。IMOLA-IVD已经成功用于监测悬浮培养和贴壁培养细胞，细胞直接接种在生物芯片。IMOLA-IVD能够自动执行毒性评价的微生理分析（Eggert et al. 2015），并在最近得到证实，微传感器可以监控重建人类表皮模型的电阻值（Alexander and Wiest 2016）。以前未尝试用于固定和监测3D细胞结构特别多细胞球体，然而在实验过程中胶原蛋白涂层导致去分化。此外，水凝胶固定导致传感器信号衰减。在此基础上我们开发了一个集成3D的新系统肝细胞球体，IMOLA-IVD无标记非侵入性代谢测量球体的参数。

Materials and Methods

IMOLA-IVD芯片系统

IMOLA-IVD芯片系统（cellasys GmbH，Munich，Germany）是一个模块化的，电化学的被动监测新陈谢和形态学参数的平台。多达6个IMOLA-IVD（Fig.1a）可安装平行在同一个气体培养箱中，进行6个样本在线平行监测。模块化结构为由模拟模块、流体系统、控制系统、BioChip、电源、数字模块和一台电脑（Fig.1b）。系统通过数字模块与电脑通信。一个模拟模块在一个BioChip上测量。实验设置通过软件模块进行编程和管理数据采集与连接DALiA2.0客户端软件。用户可以确定参数对于泵周期（ON-OFF），流量速度，以及不同溶液的加入（比如：细胞培养基、化学物质、药物等）。使用DALiA2.0，执行自定义实验，使用蠕动泵实现周期性泵ON/OFF循环。通过IMOLA-IVD系统实现自动化检测的详细实验方法在之前的文章中说明过（Eggert et al. 2015）。泵ON周期补充细胞新鲜培养基，使细胞保持活力；而泵OFF周期用来测量动态环境中芯片测量的参数，培养基酸化，消耗氧气营养。可以非侵入性地监测细胞团的新陈代谢。

 

图1、6个IMOLA-IVD（Fig.1a）可安装平行在同一个气体培养箱中，并与电脑相连用于数据存储和实验设置的控制。b图（Fig.1b）中给出了系统的模块化结构与芯片（BioChip），模拟模块对于微传感器的操作，灌流系统可以加入细胞培养基和测试药物物，连接电源，以及通信的电脑，芯片（BioChip）可以通过无标记、并行和连续实时测量监测细胞代谢参数（Fig.2a）。

 

在同一个微环境之中，使用两个交叉电极结构（IDES）传感器、两个微型pH传感器、一个电流型传感器和一个温度传感器，测量阻抗、细胞外的酸化度、氧消耗量和温度（Fig.2b）。制造传感器基底是分三步薄膜工艺进行。首先是沉积贵金属层形成传感器结构，其次通过金属氧化物薄层测量pH值（Brischwein et al. 2009），最后添加一层绝缘层来开口传感器表面和封闭电路以及完整的温度传感器。采用电化学原理操控传感器组件。pH灵敏电极（直径1.0mm）与微流体外的一个Ag/AgCl电极对应。溶解氧传感器是一个三电极的无膜克拉克电池（带工作电极，直径50μm）。读出的电化学微传感器为电压，单位为mV。由于感器高度微型化引起的（seeFigs.6 and 7，top），因此是直接转化为pH值或溶解氧浓度都是不正确的。一个常见的做法来在实验开始收集原始数据，计算基础比率，与添加化合物的速率相比（McConnell et al. 1992）。EAR和OUR数据定量分析的单位是mV/h。值得注意的是偏移会影响微传感器的绝对值，然而，灵敏度保持不变。Wiest et al. （2016）给出了实验数据，如何校正数据偏移。

在所有实验之前，系统管路是用70%乙醇消毒20分钟然后用ddH2O冲洗20分钟。装有溶液的烧瓶被连接到进行了灌流模块和预加液以清除灌流系统中的气泡。实验开始前，24h将培养系统设置为37℃。在实验之前预加液管路系统，可以清除因加热而产生的气泡。在消毒方面，在层流罩下紫外线照射BioChip20分钟。将实验设置上传到DALiA 2.0通过IMOLA支持模块（ISM）和微流泵的配置文件。配置文件包含为最佳细胞活力和实验接触设计的阀门切换时间和流速。

 

图3、a维持球体培养IMOLA系统全新球体封装设计。视图显示封装组成的标准的IMOLA微流泵头，一个分离环，一张网状过滤器，支架盘上有9个球体的孔，另一种滤网膜和支撑阀瓣。B是BioChip。C通过微流泵头和多孔膜保护细胞免受直接液体流动的剪切力，而允许进入新鲜的培养基。

球体的密封腔小室设计与制作

之前的实验已经证明，在BioChip上微反应体积中，九个球体达到可测量的EAR和OUR的。所以，我们开发出来一种球体封密封小室，允许在一个单一生物芯片长期培养多达九个球体细胞团，并且能够测量细胞外酸化度和溶解氧含量。带有3X3微孔阵列的PLA聚乳酸底板是通过Ultimaker2（UltimakerBV，Geldermalsen，Netherlands）3D打印的，并并入利用生物芯片在单个微孔中培养球体细胞团（Fig.3a–c）。九个微孔高1.5mm，直径1.2mm专为在这些洞内进行球形培养而设计的。集成的网状过滤器，网格尺寸为120μm（NY2H04700，Merck Millipore，Darmstadt，Germany）放置在球体的上面和下面，允许液体接触生物芯片的球体细胞团，同时防止球体细胞团被灌流时的液体冲洗走。在外壳环的底部放置一个包含相同大小和数量的微孔的支撑盘，在传感器芯片和支撑盘之间创建一个腔室，用于测量细胞参数。为了小型化扩散长度，支承盘和支架盘是同一方向的。最后是分离环下面加上带有入口和出口的微流泵头。在实验使用之前，打印的部件用70%乙醇消毒20分钟，然后用2次用无菌ddH2O水洗涤10分钟。

HepG2培养成HepG2球体细胞团

人肝癌细胞系HepG2（ACC180）来自从德国DMSZ（DMSZ，Braunschweig，Germany）。细胞在25cm2组织培养瓶中进行2D单层培养，RPMI-1640培养基加入10lg/ml庆大霉素，23.8mM碳酸氢钠和10%热灭活胎牛血清（FBS），37℃，95%相对湿度和5%的培养箱二氧化碳。在80-90%汇合时，去除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗。细胞用4ml0.05%胰酶和0.02%EDTA溶液处理，室温静置30s后去除胰酶/EDTA，在37℃孵育10分钟。加入4mL无血清培养基，将细胞从底部轻轻吸出。将10μl细胞悬液与10μl的0.4%台盼蓝（ThermoFisherScientific，Waltham，MA，USA）使用CountessII全自动计数器进行细胞计数（InvitrogenGmbH，Darmstadt，Germany）。接种300.000个细胞放入4mL的新组织培养瓶中，2D单层培养。培养基每周更换两次。除了特别注释，所有化学试剂和溶液都是从Sigma-AldrichChemieGmbH（Taufkirchen，Germany）采购的。

细胞计数后，200μl 1000个细胞转移到低吸附表面的U-形96孔板中（650970，GreinerBio-One International GmbH，Kremsmu¨nster，Austria），以1000g离心5分钟。前4天每天更新50%体积的培养基。优化的培养方案之前报道过的，每个球体接种250，500，1000，2000，4000和8000个细胞，采用ImageJ定量分析图像（Eggert et al. 2017）。

微流体和传感器的动力学特性

对该装置进行了流体流动实验设计球体的密封小室，将滤网放置在pH和阻抗传感器上评估响应和稳定时间。两个独立的PBS标准品，PBS1和PBS2，在预先设定的流程中，具有明显的渗透性和pH值的溶液灌注通过生物芯片，进行测试。预先设定的流程包括以100μL/min流速流入PBS1连续2h（渗透压：300mOsm/Kg；pH：7.4），然后同样的速度流入PBS2（渗透压：600mOsm/Kg；pH：6.4）连续2h。对信号进行了监控24小时。用于流量和传感器的特性研究动力学，三个独立实验（n=3），使用开发的微孔系统，九个球体细胞团。

芯片上的球体培养及代谢监测

芯片上的球体与密封设计是用以之前报道的方案。通过IMOLA-IVD，进行可行性研究以进行评估进行代谢监测的潜力，为最大传感器响应值选择最佳泵周期。为了做芯片监控，单个球形培养使用优化的生长程序被移液进入微孔进行实时监测实验。九个培养好的球体细胞团被移液进入支架盘上的微孔生物芯片。每个球体都是在单次移液至微孔直至每个微孔包含一个球体。随后，成功地将球体移液到微孔中用显微镜分析。使用IMOLA-IVD平台监测三个独立进行代谢实验（n=3）微孔中九个球体。对HepG2球体代谢监测的前25h，泵循环为1小时开1小时关（1h ON/OFF）。随后24小时，泵循环为1h ON/OFF然后泵循环为30分钟开30分钟关（30min ON/OFF），ON/OFF。泵循环ON打开的时候，以100μL/min灌流细胞培养液。在泵关和开阶段，每5秒通过BioChip记录一次细胞外酸化度。

加入SDS

作为一项验证研究，十二烷基硫酸钠阴离子表面活性剂SDS（SDS）加入生物芯片的球体，以测定其对细胞代谢的毒性作用。SDS是常用作阳性对照细胞毒性测定标准物质，如细胞传感器微生理仪毒性试验（Hartung et al. 2010）。加入SDS，到密封装置中的球体。前10小时，无缓冲培养以100μL/min的速度连续灌流培养基。1小时泵开，1小时泵关。36h后，含1% SDS培养液，相同的泵再灌流24小时。每5s记录一次BioChip的细胞外酸化度和耗氧量。

细胞微生物测量数据的处理

从记录的信号中提取细胞外酸化率（EAR）和耗氧率（OUR）进行SDS加入后的数据分析。计算SDS加入前的20小时的EAR和OUR（实验时间：16-36h），SDS加入后的20h（实验时间：36-56小时）。通过专有的R-script采用简单线性回归，提取的梯度变化。进一步的关于细胞微生理测量的数据处理，可以参考Wiest et al.（2016）。

 

Results and Discussion

流动特性研究的结果

两个独立的PBS标准品，PBS1和PBS2，在预先设定的流程中，具有明显的渗透性和pH值的溶液灌注通过生物芯片，进行测试。预先设定的流程包括以100μL/min流速流入PBS1连续2h（渗透压：300mOsm/Kg；pH：7.4），然后同样的速度流入PBS2（渗透压：600mOsm/Kg；pH：6.4）连续2h。对信号进行了监控24小时。预先设定的流程，详见Weiss et al.（2013）。

在最初的密封腔中，反应小室最大体积为6μL。灌流4秒后溶液就被全部更换。因此，PBS溶液的变化引起的芯片上pH传感器的响应非常迅速。溶液与传感器接触200秒后pH值达到稳定。多层椭球封装组件对传感器的响应时间有显著影响，如图4所示。需要注意的是，在新的设计上，总反应室的体积增加到40μL左右。这会减慢更换溶液时传感器的反应。此外，过滤网作为一种传感器表面的屏障，改变了正常的灌流。对于已开发120μm的尼龙网的密封腔，稳定状态，保持达到PBS2（pH6.4），但与PBS1不一致。这是可能是由于在设定的流速下两种PBS溶液混合不均匀。然而，值得注意的是流动时间之后，测量的pH值返回可重复的水平，允许用户根据初始值校准pH值的变化（校正传感器漂移）。

芯片上的球体培养及代谢监控

最后，利用优化后的方法生长出成熟的球体，采用无缓冲培养基灌注泵试验，放置在几个不同的芯片上，监测扩大培养和pH值。九个球体嵌入到为观察pH值打印的微孔中。图5显示了1hON/OFF（图5a）和30分钟开/关（图5b）的pH值的区别。

pH值信号表示在两个泵的关闭阶段的溶液的酸化度，代表在芯片上球体的代谢活动。对于1h泵循环，生物芯片上的球体的EAR的值为24mV/h（±4）。当泵ON，pH信号30min内下降28-32mV，并在后续30分钟继续逐渐下降3-5mV/h，。当泵循环变为30分钟，EAR增加到39mV/h（±2）。通常，pH值信号表明长时间的泵OFF，细胞减少新陈代谢速速率以及pH信号向渐近线漂移。细胞在酸性环境下减少新陈代谢速速率，就像细胞发现在他们周围聚集代谢的废物。

在泵OFF时，在腔内新陈代谢的废物的增加，导致pH传感器测量的溶液（腔体和管线中的电极之间的）的pH值下降，。在后续泵ON时，泵通过管道灌流新鲜溶液到小室，并与旧的溶液混合在一起。因为小室被多孔材料分成几个隔间膜层与椭球腔阵列，需要一定时间将新鲜的溶液扩散到各个不同的室。这个过程受限于膜的孔径大小，溶液的流速和粘度。此外，球体本身可能会阻碍上面的通道和下面的传感器之间的溶液更换。

图5、HepG2球体细胞团的胞外pH值监测。采用椭球腔阵列设计，泵周期为a：1小时ON和1小时OFF和b：30分钟ON和30分钟OFF。pH信号的变化以mV（黑色）表示，泵为ON或OFF（蓝色）。一个在泵OFF阶段观察到pH信号的增加。在泵ON时，pH信号减少到一个基准线。4.3. 小鼠成纤维细胞对十二烷基硫酸钠培养基的代谢反应。

加入SDS

添加1%SDS的无缓冲RPMI-1640培养基是否作为阳性对照溶液，36小时后球体细胞裂解并停止代谢活动。之前溶液中加入1%的SDS，在1小时的OFF期间对溶液酸度进行监测。当泵ON时，得到pH值信号在18-24min内立即增加55-65mV增加的速度为4-10mV/h（Fig.6a）。1h泵OFF时，pH值信号变化率EAR值为38mV/h（±5）（Table1）。当泵ON时，pH值信号立即下降到一个基础线。1%SDS的加入可降低大约100mV，在随后的泵OFF时EAR为8mV/h（±8）。SDS加入后14h，pH值信号达到一个平稳期，在接下来的10小时内，以1mV/h的速度向上漂移，直到实验停止。SDS加入之后pH值上升是由于pH值的变化，实验后pH测量结果显示RPMI-1640值为7.41，添加1%SDS的RPMI-1640pH值为为7.32。归一化的EAR显示了类似原始pH信号的趋势（Fig.6b）。

 

同时记录的氧信号也反映了加入1%的SDS引起的毒性效果。图7a显示了加入SDS前后的耗氧量。在没有SDS的灌流中，泵OFF的1小时，氧信号增加283-324mV，OUR为308mV/h（±21）。泵ON后，信号立即改变，在18-22分钟内OUR降低245–289mV，随后有一个向下偏移。加入1%的SDS引起瞬间变化，在11.5min内降低473mV测量信号值的变化。泵OFF.，信号值也没有变化，说明没有氧气消耗。加入SDS后OUR值降低至-2mV/h（±13）。加入SDS后，归一化的OUR信号在一个泵周期内下降到基线（Fig.7b）。

记录的温度数据没有显示任何代谢活动。此外，阻抗值不显示活性，但是加入阴离子SDS后阻抗值会降低。Schmid et al. （2016）报道了这一点——不同的电极排布——测量球体的阻抗值。

 

Conclusions

总之，通过IMOLA-IVD监测细胞外酸化率以及耗氧率，可以以时间分辨、无标签测量的方式来记录球体细胞团的代谢参数。理论上，终点实验，需要长期的冗余的采样，用于体外毒性研究。然而，使用化学物质标记测试可能会改变代谢功能，产生假的毒性结果。在文中展示的工作中，我们介绍了如何用生物芯片代替化学标签电化学传感器，克服化学物质标记的缺点，保存对于精确的毒性的原始状态的评估。此外，传感技术可以从单个样本中获得的数据扩展数据量。

本文测试了一种新颖的封装方式设计膜屏障材料。使用不同pH值的PBS溶液作为标准品表征渗透压值。说明了该系统通过显示PBS溶液更换时，新型芯片的瞬时pH和酸化响应，实现球体细胞团代谢监测。培养9个球形细胞，每组3X3个微孔，作为创新的嵌入设计，在整个实验过程中测量代谢活性的变化。加入SDS培养基裂解细胞，停止了细胞的氧气消耗并改变收pH传感器的细胞外酸化率。

最后，本研究是一个初步的方法，建立新一代“球体组织芯片”分析方案，基于无标签，实时监控球体细胞团，用于体外毒性试验，可以在体外三维组织培养模型中，对候选药物进行药物扩展分析。相比现有的方法中，文中所开发的微生理测量平台具有优势能够记录毒性反应期间的实时动力学。此外，IMOLA-IVD自动化可以实现高度的重复性。总之，改系统提供了一个“随时可用”毒理检测平台，为将来更准确地预测药物安全性和功能性开拓新的道路。

 

Acknowledgments: F. Alexander would like to thank the Whitaker International Program for their financial support of this work. The authors would also like to thank the Deutscher Tierschutzbund—Akademie fu¨r Tierschutz (German Animal Welfare Federation—Animal Welfare Academy).

 

 

北京佰司特科技有限责任公司 (https://www.best-sciences.com):

类器官串联芯片培养仪-HUMIMIC；灌流式细胞组织类器官代谢分析仪-IMOLA；光片显微镜-LSM-200；

蛋白质稳定性分析仪-PSA-16；单分子质量光度计-TwoMP；超高速视频级原子力显微镜-HS-AFM；

全自动半导体式细胞计数仪-SOL COUNT；农药残留定量检测仪—BST-100；台式原子力显微镜-ACST-AFM；微纳加工点印仪-NLP2000/DPN5000；