前沿进展：质量光度计—最新的单分子组分和功能研究的方法

前沿进展：质量光度计——最新的单分子组分和功能研究的方法

Mass Photometry

翻译整理：北京佰司特科技有限责任公司

   

2018年，牛津大学(University of Oxford)的菲利普·库库拉(Philipp Kukura)和他的同事宣布了他们开发的一项技术，称为质量光度法，通过单个分子散射光的方式来测量它们的重量。这种方法提供了一种全新的分析生物分子的方法，具有一些关键的优点。质量光度法可以使样品保持在缓冲溶液中，而不是按照天然质谱法的要求将样品移到真空中。与色谱法不同的是，色谱法需要相当大的样本量，而质量光度法只能读取几微升的纳摩尔浓度溶液。最重要的是，与色谱法大约一小时的时间相比，处理时间大约是一到两分钟。

牛津大学(University of Oxford)很快推出了Refeyn，将质量光度法商业化，其Refeyn OneMP仪器于2019年3月上市，该公司的首席营销官Matthias Langhorst说，该工具的应用范围从简单的纯度测试(例如质量峰的数量将表明样品中有多少种蛋白质)到更复杂的生物分子组装在不同条件下的行为分析。

麻省理工学院(MIT)研究细胞核孔复合体的托马斯·施瓦茨(Thomas Schwartz)是该设备的早期测试者，他一听说质量光度法就去找库库拉。他说:“这个仪器最有价值的地方是，我们可以观察复杂的蛋白质-大分子复合物，并找出混合物中的成分，我们是否能检测出稳定性的问题。”“在典型的工作流程中，这是一个非常耗时的过程。”

Wiley:“这些原理并不新鲜，但这个新设备的实现非常聪明和强大，因为它可以测量场中的每一个粒子。非常强大，具有潜在革命性的工具。”

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Mass photometry （MP） 是一种无标记的单分子分析技术，基于检测玻璃-水界面上单个粒子散射的光。例如，来自单个蛋白质的弱散射信号，是根据来自界面反射的数量级强的背景信号进行量化的。MP数据只是一系列图像（图1）。对于这一系列中的每一幅图像，取N帧的平均值，然后除以后续N帧的平均值，以揭示当一个分子落在玻璃表面时，信号发生了多少变化。 
由单个分子产生的信号与分子质量成线性比例。已知分子质量的标准样品被用来做标准。因此，MP可以准确地测量未知样品的质量。 

NOISE SOURCES IN MASS PHOTOMETRY

MP最终受到散粒噪声shot noise 的限制，散粒噪声源于光的量子性质，导致到达检测器的光子数量随机波动。玻璃表面的反射产生了非常不均匀的图像，这种不均匀性和散粒噪声是信号波动的主要来源。此外，来自机械振动或样品台侧向漂移的背景波动都会影响数据质量。

SINGLE MOLECULE DETECTION

当单个分子与玻璃表面相互作用时，它们会在比率图像中产生特征信号。生物分子比成像的波长要小得多，因此信号被表示为点扩散函数（PSF）。点扩散函数描述了成像系统对点光源的响应，并取决于成像波长和物镜的数值孔径（NA）。波长越短，NA越高，PSF形状越小。 

因此，在同一台仪器上测量不同质量的分子，其PSF的形状相同，但强度不同。例如，甲状腺球蛋白的质量是牛血清白蛋白（BSA）的10倍，因此其信号强度是牛血清白蛋白的10倍。在1分钟的采集过程中，检测到数百个分子着陆玻璃的事件，提供了两种分子的质量分布的直接信息。

事件需要在时间和空间上很好地分离，否则由于PSF重叠而产生的拟合误差会掩盖结果。因此，将样品浓度保持在允许单分子检测的水平（通常为100 nM）是很重要的，所以MP测量所需的样品量非常低。

ACCURACY 

MP直方图中的峰值可以用高斯近似拟合，峰值中心表示成分的测量质量。MP测量的质量可能会由于测量、校准和拟合等一系列因素而偏离预期值。通常，误差在预期值的5%以内。重复实验可以通过平均单个实验的误差来提高精确度，从而更好地评估校准误差。 

DETECTION RANGE

准确检测和量化PSFs的能力取决于比率画面中的噪声水平。平均更多的帧来计算比率视频中的每个比率图像，减少了每个比率图像中镜头噪声引起的波动，提高了信背景比，并使检测更低质量的分子成为可能。平均更多帧的缺点是时间分辨率的降低。可能需要降低蛋白质浓度以防止PSFs重叠。但是，由于横向漂移，较长的平均时间可能会影响数据质量。因此，对质量接近检测极限的分子的测量可能需要对更多帧进行平均，同时注意漂移。更大的分子产生更强的信号，因此需要更少的帧平均。MP覆盖的质量范围可以通过蛋白A （42 kDa）和AAV粒子（~3.7 MDa）来说明，AAV粒子的质量是蛋白A 的100倍，产生的信号强度也是MP的100倍。 

RESOLUTION

分辨率，即多峰分布图，峰与峰之间可分离的最小距离，直接与单个峰的宽度有关。标准偏差通常为质量（即峰的中心所示的质量）的~10%。峰距的分辨率取决于样品的组成和纯度，以及相对浓度。假设两个峰的高度相等，当两个峰的中心距离大于最大半宽值（FWHM）之和，两个峰可以被分辨出来。对低质量的蛋白质,MP可以分辨的峰距约为~25 kDa （如：BSA和蛋白A ）（图5），更大质量的蛋白质,如甲状腺球蛋白（670 kDa） 的分辨的峰距会增加至约~ 85 kDa，由于甲状腺球蛋白较大的FWHM（这部分源于高度糖基化）。 

Mass photometry （MP） 是一种无标记的单分子分析技术，基于检测玻璃-水界面上单个粒子散射的光。例如，来自单个蛋白质的弱散射信号，是根据来自界面反射的数量级强的背景信号进行量化的。MP数据只是一系列图像（图1）。对于这一系列中的每一幅图像，取N帧的平均值，然后除以后续N帧的平均值，以揭示当一个分子落在玻璃表面时，信号发生了多少变化。 
由单个分子产生的信号与分子质量成线性比例。已知分子质量的标准样品被用来做标准。因此，MP可以准确地测量未知样品的质量。 

NOISE SOURCES IN MASS PHOTOMETRY

MP最终受到散粒噪声shot noise 的限制，散粒噪声源于光的量子性质，导致到达检测器的光子数量随机波动。玻璃表面的反射产生了非常不均匀的图像，这种不均匀性和散粒噪声是信号波动的主要来源。此外，来自机械振动或样品台侧向漂移的背景波动都会影响数据质量。

SINGLE MOLECULE DETECTION

当单个分子与玻璃表面相互作用时，它们会在比率图像中产生特征信号。生物分子比成像的波长要小得多，因此信号被表示为点扩散函数（PSF）。点扩散函数描述了成像系统对点光源的响应，并取决于成像波长和物镜的数值孔径（NA）。波长越短，NA越高，PSF形状越小。 

因此，在同一台仪器上测量不同质量的分子，其PSF的形状相同，但强度不同。例如，甲状腺球蛋白的质量是牛血清白蛋白（BSA）的10倍，因此其信号强度是牛血清白蛋白的10倍。在1分钟的采集过程中，检测到数百个分子着陆玻璃的事件，提供了两种分子的质量分布的直接信息。

事件需要在时间和空间上很好地分离，否则由于PSF重叠而产生的拟合误差会掩盖结果。因此，将样品浓度保持在允许单分子检测的水平（通常为100 nM）是很重要的，所以MP测量所需的样品量非常低。

ACCURACY 

MP直方图中的峰值可以用高斯近似拟合，峰值中心表示成分的测量质量。MP测量的质量可能会由于测量、校准和拟合等一系列因素而偏离预期值。通常，误差在预期值的5%以内。重复实验可以通过平均单个实验的误差来提高精确度，从而更好地评估校准误差。 

DETECTION RANGE

准确检测和量化PSFs的能力取决于比率画面中的噪声水平。平均更多的帧来计算比率视频中的每个比率图像，减少了每个比率图像中镜头噪声引起的波动，提高了信背景比，并使检测更低质量的分子成为可能。平均更多帧的缺点是时间分辨率的降低。可能需要降低蛋白质浓度以防止PSFs重叠。但是，由于横向漂移，较长的平均时间可能会影响数据质量。因此，对质量接近检测极限的分子的测量可能需要对更多帧进行平均，同时注意漂移。更大的分子产生更强的信号，因此需要更少的帧平均。MP覆盖的质量范围可以通过蛋白A （42 kDa）和AAV粒子（~3.7 MDa）来说明，AAV粒子的质量是蛋白A 的100倍，产生的信号强度也是MP的100倍。 

RESOLUTION

分辨率，即多峰分布图，峰与峰之间可分离的最小距离，直接与单个峰的宽度有关。标准偏差通常为质量（即峰的中心所示的质量）的~10%。峰距的分辨率取决于样品的组成和纯度，以及相对浓度。假设两个峰的高度相等，当两个峰的中心距离大于最大半宽值（FWHM）之和，两个峰可以被分辨出来。对低质量的蛋白质,MP可以分辨的峰距约为~25 kDa （如：BSA和蛋白A ）（图5），更大质量的蛋白质,如甲状腺球蛋白（670 kDa） 的分辨的峰距会增加至约~ 85 kDa，由于甲状腺球蛋白较大的FWHM（这部分源于高度糖基化）。 
 

 

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