应用案例：蛋白稳定性分析仪PSA-16助力生物传感器开发

01 前言

在固定化尿酸氧化酶（UOX）的高稳定性和保留的催化活性是实现尿酸（UA）精确传感器的关键。本研究开发了一种基于自组装固定化UOX的电化学UA生物传感器，通过在纤维素修饰电极上融合碳水化合物结合模块（CBM）来促进UA的检测。借助计算结构导向的酶工程策略，证明了N端CBM3融合的结构稳定性优于C端融合的CBM3或CBM2。进一步删除了预测对CBM3-UOX结构稳定性有害的CBM3 N端残基（P2VSG5）和连接区残基（K158EPMSN163），构建了CBM3-Δ10aa-UOX，与戊二醛交联的UOX生物传感器（0-0.375 mM，5天）相比，显著提高了UA生物传感器的可靠性，在0至0.625 mM UA范围内表现出线性关系，R2 > 0.99，可持续20天。此外，通过野生型UOX和CBM3-Δ10aa-UOX的共固定化（0-0.875 mM，> 34天，R2 > 0.99），探究了融合UOX在初始阶段电流增加的机制，并将其归因于UOX亚基之间的相互作用和连接肽断裂，进一步证明了CBM3-Δ10aa-UOX连接肽的增强稳定性可延长电流增加过程并提高工作寿命。本研究强调了自组装固定化在推进生物传感器领域的有效性，并为类似多聚体生物传感器的进化提供了稳健的策略。

02 摘要

尿酸（UA）是一种在血清和尿液等生物体液中广泛存在的关键含氮化合物，是嘌呤代谢的主要终产物。健康个体血清中UA的正常水平分别为成年男性约0.21-0.43 mM和成年女性约0.15-0.36 mM，而在痛风患者中，UA浓度可高达1.49-4.46 mM。生物体液中UA水平的异常可提示痛风、代谢综合征和肾脏疾病等疾病，使其成为检测嘌呤代谢相关疾病的有用生物标志物。因此，生物体液中UA的快速可靠检测通常对其诊断和治疗至关重要。

目前，已开发出多种UA测定方法，包括高效液相色谱法（HPLC）、分光光度法、离子色谱法、HPLC/同位素稀释质谱法（ID-MS）和电化学生物传感方法。在这些方法中，基于尿酸氧化酶（UOX或尿酸酶，EC 1.7.3.3）氧化还原催化的电流型酶生物传感器因其简单性、灵敏度、特异性和快速响应而受到广泛研究关注。UOX反应方程式如下：UA + 2H2O + O2 → 尿囊素 + H2O2 + CO2。在生物传感过程中，固定在电极上的UOX与UA反应，消耗O2并产生H2O2。减少的O2或氧化的H2O2与UA浓度成正比，氧化或还原信号可通过换能器和电子放大器转换并放大为可读的物理信号。因此，固定化UOX的高稳定性和保持的催化活性是实现UA精确传感的关键。

在先前报道的研究中，已利用不同类型的酶固定化技术构建电流型UA生物传感器。物理吸附和包埋法常用于UOX固定化，但其吸附过程的结合力较弱，易受环境变化影响，从而降低相应生物传感器的操作和储存稳定性。UOX包埋通常使用聚苯胺（PANi）和聚吡咯等聚合物实现。然而，固定化酶从这些聚合物中的泄漏可能影响其稳定性。使用戊二醛或碳二亚胺等双功能试剂在酶与载体或牛血清白蛋白（BSA）之间形成稳定共价键的共价结合和交联方法也是化学固定UOX的常用方法，可避免酶的解吸和泄漏。然而，共价结合法引起的广泛酶失活和低重复性限制了其在生物传感器中的应用。最近，亲和吸附法已被证明是一种有前景的酶固定化策略，可提高酶生物传感器的性能。此外，通过基因工程将来自家族2的碳水化合物结合模块（CBM2）与葡萄糖氧化酶融合，以促进葡萄糖传感性能。然而，UOX的结构和催化机制与葡萄糖氧化酶完全不同，因此探索构建稳定且具有活性的CBM融合UOX作为UA生物传感元件仍然至关重要。

UOX是一种功能性四聚体桶状结构，其活性位点由来自两个单体的界面残基形成。每个单体包含两个具有ββααββ反平行超二级结构的相同结构域，称为隧道折叠结构域。某些弱相互作用（非共价键、次级键），包括范德华力、氢键、盐键（解离键）和疏水相互作用，参与稳定四级结构。此外，亚基之间形成的紧密界面处极性和疏水基团的互补排列促进了特定亚基的关联。在UOX催化过程中，采用无辅因子方式促进和控制O2化学，提出了类似于黄素依赖性氧化酶或黄素依赖性单加氧酶的不同催化机制，但其作用机制尚未完全阐明。由于UOX的多亚基依赖性催化活性和模糊的催化机制，过去几十年中关于性能改进的工程化UOX的研究报道较少。因此，构建稳定的基因融合UOX是一项重大挑战。

串联融合是构建合成融合蛋白的一种流行且可行的策略。使用该策略获得理想的融合蛋白时，应仔细考虑两个不可或缺的要素：融合伙伴之间的最佳结构域放置顺序和选择合适连接子将蛋白质结构域连接在一起。融合蛋白的盲目设计可能导致多种不良后果，包括结构域错误折叠、蛋白质产量低和生物活性降低。由于专门用于蛋白质结构预测和蛋白质合理设计的计算程序（如AlphaFold2、PROCHECK、AutoDock Vina和GROMACS ）的显著发展，可以更好地理解融合蛋白结构并避免许多不良结果。

03 结果

为了对所有UOXs进行更全面的结构表征，作者采用了差示扫描荧光法（DSF）[34]进行热稳定性测定。如图S7所示，UOX-CBM3和UOX-CBM2的峰形更为不对称，尤其是UOX-CBM2，这表明CBM与UOX断裂诱导了多个结构域的协同变性。相比之下，CBM3-Δ10aa-UOX的DSF峰最为对称且最窄，验证了其结构稳定性，这与分子动力学模拟和SDS-PAGE分析的结果一致。

04 方法

使用北京佰司特科技有限责任公司生产的 PSA-16 蛋白稳定性分析仪对目标蛋白的热稳定性进行了评估。首先将样品稀释至 0.5 毫克/毫升的浓度。然后，将 20 微升稀释后的样品置于石英玻璃管（产品编号 LG-002，同样来自北京佰司特科技有限责任公司）中。

采用线性温度扫描法，测量 330 nm和 350 nm处的内源性蛋白质荧光强度。温度范围为 23 至 97 ℃，升温速率为每分钟 1 ℃。根据 F350/F330 曲线的斜率计算出热变性中点温度（Tm）。每个样品均重复测量四次。

05 结果

在本研究中，作者借助结构引导的酶工程策略构建了一系列CBM融合尿酸氧化酶，并探索了影响融合UOX作为生物传感元件稳定性的关键因素，结果表明CBM3 N端连续残基（P2、V3、S4、G5）和158至163位（K158EPMSN163）域间锚定区域对CBM融合UOX结构稳定性的关键作用。删除不稳定残基后，UA生物传感器的可靠性显著提高。本研究有助于合理构建具有可调和可预测特性的融合UOX，并为制造优异的UA生物传感器提供了理想候选者。

为了对所有 UOX 进行更全面的结构表征，作者使用差示扫描荧光法（DSF）[34] 进行了热稳定性测定。如图 S7 所示，UOX-CBM3 和 UOX-CBM2 的峰形更不对称，尤其是 UOX-CBM2，这表明由于 CBM 和 UOX 的断裂，多个结构域协同变性。相比之下，CBM3-Δ10aa-UOX 的差示扫描荧光（DSF）峰最对称且最窄，这证实了其结构稳定性，正如分子动力学（MD）模拟和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析所表明的那样。

北京佰司特科技有限责任公司 (https://www.best-sciences.com)

类器官串联芯片培养仪—HUMIMIC；灌流式细胞组织类器官代谢分析仪—IMOLA；光片显微镜—LSM-200；

蛋白稳定性分析仪—PSA-16；单分子分析仪（磁镊力谱测量仪）—HiMT；单分子质量光度系统—TwoMP；超高速视频级原子力显微镜—HS-AFM；微流控扩散测量仪—Fluidity One-M；

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