多功能蛋白稳定性分析仪—PSA-16

 

多功能蛋白稳定性分析仪—PSA-16

 

北京佰司特科技有限责任公司于2023-10-01日推出了自主研发的第一款国产蛋白稳定性分析仪，该设备性能和参数达到进口设备的水平，价格却远低于进口产品，弥补了目前国产自主设备在蛋白稳定性专业研究分析领域的空白。多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16是一款无需荧光染料、高通量、低样品消耗量的检测蛋白质稳定性的设备。该设备基于内源差示扫描荧光技术（intrinsic fluorescence DSF），通过检测温度变化/变性剂浓度变化过程中蛋白内源紫外荧光的改变，获得蛋白质的热稳定性(Tm值)、化学稳定性（Cm值）等参数。可应用于蛋白缓冲液条件筛选及优化、小分子与蛋白结合情况的定性测定、蛋白质修饰及改造后的稳定性测定、蛋白变/复性研究、不同批次间蛋白稳定性对比等多个方面。

 

技术原理：

蛋白跟核酸不一样，核酸都是由四个碱基组成，只是组成的顺序不一样，但是整体的结构都是类似的双螺旋结构。而蛋白由20多种不同氨基酸组成，需要折叠成正确的三维结构才能发挥自身作用。所以每个不同功能的蛋白长得样子其实都是不同的。

蛋白的高级结构决定其功能，行使功能需要正确折叠。​蛋白由20多种不同氨基酸组成，需要折叠成正确的三维结构才能发挥自身作用。蛋白质在一定的物理和化学条件（加热、加压、脱水、振荡、紫外线照射、超声波、强酸、强碱、尿素、重金属盐、十二烷基硫酸钠）下，其空间构象容易发生改变而失活，因此研究蛋白的构象和构型变化对其应用有重要的价值。蛋白质的变性作用主要是由于蛋白质分子内部的结构被破坏。天然蛋白质的空间结构是通过氢键等次级键维持的，而变性后次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有序的卷曲的紧密结构变为无序的松散的伸展状结构（但一级结构并未改变）。热变性是蛋白质变性中最常见的一类现象。

蛋白质的热稳定性是指蛋白质多肽链在温度影响下的形变能力，主要体现在温度改变时多肽链独特的化学特性和空间构象的变化，变化越小热稳定性越高。蛋白质的热稳定性受到不同温度、pH值、离子强度等外界因素的影响，在生物技术、药物研发以及食品工业等领域，具有重要意义。

蛋白质变性温度是生物学家们研究蛋白质的热稳定性的一个重要的概念，是指蛋白质在特定温度条件下受到热力作用时，其结构发生变化的温度点，一般温度较高时，蛋白质从稳定的三维结构变化成松散的无序结构。蛋白质的热稳定性一般使用热变性中点温度(melting temperature，Tm)来表示，即蛋白质解折叠50%时的温度。蛋白质的热变性过程与其空间构象的改变密切相关，Tm值能反映变温过程中蛋白质构象改变的趋势，是衡量蛋白质热稳定性的一个重要指标。蛋白质Tm值的测定在生物医药行业具有广泛的应用，如嗜热蛋白、工业酶等的改造与筛选，蛋白质药物与配体、制剂或辅料的相互作用，蛋白质药物的缓冲液稳定条件筛选等。

差示扫描荧光法(differential scanning fluorimetry, DSF)是一种方便快捷的高通量药物筛选及靶标发现的方法，通过荧光染料或蛋白内源荧光信号检测升温过程中蛋白构象的变化计算其熔解温度Tm（折叠蛋白与去折叠蛋白相等时的温度）。蛋白中的色氨酸和酪氨酸可以被280 nm的紫外光激发并释放出荧光，其荧光性质与所处的微环境密切相关。蛋白变性过程中，色氨酸从疏水的蛋白内部逐渐暴露到溶剂中，荧光释放的峰值也从330 nm逐渐转移到350 nm。该方法具有蛋白样品消耗量少、通量高、温度变化范围广及数据准确等优点，被广泛用于蛋白质稳定性（蛋白质热稳定性参数及其影响因素）、蛋白结构和构象、蛋白-配体相互作用及蛋白质稳定剂、抑制剂、辅助因子等领域的研究。

1.    抗体或疫苗制剂、酶制剂的高通量筛选

2.    抗体或疫苗、酶制剂的化学稳定性、长期稳定性评估、等温稳定性研究等

3.    生物仿制药相似性研究（Biosimilar Evaluation）

4.    抗体偶联药物（ADC）研究

5.    多结构域去折叠特性研究

6.    物理和化学条件强制降解研究

7.    蛋白质变复性研究（复性能力、复性动力学等）

8.    膜蛋白去垢剂筛选，膜蛋白结合配体筛选（Thermal Shift Assay）

9.    基于靶标的高通量小分子药物筛选（Thermal Shift Assay）

10.    蛋白纯化条件快速优化等

 

 

 

差示扫描荧光法(differential scanning fluorimetry, DSF)包括两种：染料法DSF、内源DSF（intrinsic DSF）。

 

最常用的染料法DSF是通过标记染料来检测升温过程中蛋白构象的变化。比如SYPRO Orange，是一种环境敏感的疏水染料，当温度升高时，蛋白去折叠，疏水部分暴露出来，染料与蛋白质的疏水部分特异性结合，荧光增强。在有特定化合物或配体结合的情况下，蛋白稳定性会上升，表现为熔解温度的上升。

内源DSF（intrinsic DSF）则是基于蛋白去折叠过程中色氨酸发射光谱的位移进行检测。通过检测温度变化/变性剂浓度变化过程中蛋白内源紫外荧光（350 nm/330 nm比值）的改变，获得蛋白的热稳定性(Tm值)、化学稳定性（Cm值）等参数。相比传统的方法，无需添加染料，通量高，样品用量少，数据精度高。

 

 

产品介绍：

多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16是一款无需加入荧光染料、高通量、低样品消耗量检测蛋白质稳定性的设备。该设备基于内源差示扫描荧光技术（intrinsic fluorescence DSF），在天然条件下，根据内源荧光和散射光的变化与三级结构变化的关系，通过检测温度变化/变形剂浓度变化过程中蛋白内源紫外荧光的改变，获得蛋白质的热稳定性(Tm值)、化学稳定性（Cm值）等参数，无需对蛋白进行荧光标记，可以直接测定蛋白在不同缓冲液条件中的Tm值。

PSA-16可用于测定不同buffer中蛋白的Tm值变化，获得蛋白质正确折叠的最ZUI优buffer条件；测定不同detergent条件下膜蛋白Tm值，进行detergent筛选；测定不同添加剂对蛋白稳定性的影响；测定添加配体后Tm值变化进行配体结合筛选；测定蛋白中变性部分的比例，进行质量控制；测定蛋白Tm值与浓度的相关性，获得最ZUI优蛋白浓度进行后续结晶等实验；测定蛋白去折叠过程，进行蛋白复性条件筛选；测定蛋白folding enthalpy，研究蛋白的长期稳定性；测定不同批次和存储后的蛋白的稳定性，并进行相似性评分，对蛋白进行质量控制。

 

 

★    280nm激发光下，蛋白以色氨酸(Trp)释放的紫外荧光为主

★    Trp荧光光谱与其所处微环境密切相关

★    折叠状态Trp在蛋白内部疏水核心；蛋白去折叠后，Trp暴露到溶剂中

★    去折叠过程, Trp Emission峰值从330nm转变到350nm，蛋白紫外荧光发生红移现象

★    350nm与330nm荧光值的比值变化，即可检测到蛋白去折叠过程

★    测定参数：Tm、Ton、Cm、ΔG等

★    条件无限制，可测定去垢剂环境中的膜蛋白

 

主要功能：

多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16可用于评估蛋白（抗体或疫苗）热稳定性、化学稳定性、颗粒稳定性等特性，实现非标记条件下的高通量的抗体制剂筛选、分子结构相似性鉴定、物理稳定性、长期稳定性、质量控制、折叠和再折叠动力学研究等功能。

★    蛋白热稳定性分析

★    蛋白化学稳定性分析

★    蛋白等温稳定性分析

★    蛋白颗粒稳定性分析

★    免标记热迁移实验（dye-free TSA）

★    蛋白去折叠、再折叠、结构相似性分析

★    蛋白质量控制分析

 

主要特点：

多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16基于内源差示扫描荧光（ifDSF）技术，广泛应用于蛋白质稳定性研究、蛋白质类大分子药物（抗体）优化工程、蛋白质类疾病靶点的药物小分子筛选和结合力测定等领域，去垢剂环境中的膜蛋白和高浓度抗体制剂的稳定性研究。此外，PSA-16具有非常高的数据采集速度，从而可提供超高分辨率的数据。同时一次最多可同时测定16个样品，通量高；每个样品仅需要10-20 uL，样品用量少，非常适合进行高通量筛选。操作简单，使用后无需清洗，几乎无维护成本，具有快速、准确、高通量等诸多优点。

 

 

主机参数：

★    测定参数：Tm、Cm、ΔG等；

★    样品通量：16个；

★    样品体积：≤20 uL；

★    检测器：检测330+/-5 nm和350+/-5 nm两个波长的信号；

★    检测模式：快速逐个扫描，1秒钟采集一次信号；

★    激发光源：LED，波长280 nm；

★    浓度范围：0.01-300 mg/ml；单次实验即可涵盖此浓度范围；

★    温控范围：15-110度；

★    变温速度：0.1-15度/分钟；

★    温度准确性：+0.05度；

★    Tm重复性：同一台机器16个重复样品CV小于1%；

★    对缓冲液条件无限制，可测定去垢剂环境中的膜蛋白；

★    能够实现热稳定性、化学稳定性、胶体稳定性、等温稳定性、质量控制等测定；

★    仪器无需定期更换配件，实验完成后无需对仪器进行清洗维护；

 

耗材参数：

★    一次性耗材，无需清洗；成本低；

★    样品管采用高纯度石英材质，紫外透过率高，可检测低浓度的蛋白样品；

★    八联排设计，使用灵活，适配多通道移液器进样；

★    可密封式设计，防止实验过程中的样品蒸发；
 

 

 

应用领域：

蛋白质是生物体中广泛存在的一类生物大分子，具有特定立体结构的和生物活性以及诸多功能，根据这些功能我们可以将其应用于蛋白质的分子设计、蛋白质功能的改造、疾病的基因治疗以及新型耐抗药性药物的开发与设计甚至是发现生物进化的规律等先进科研领域上。因此，蛋白质具有非常重要的研究价值。进行蛋白质性质和功能研究的前提是获得稳定的蛋白质样品，而由于蛋白质自身性质的复杂性，难以保证获得的蛋白质样品是否具有正确的三维结构以及功能，因此急需一种技术手段或设备，对蛋白质的稳定性进行分析，确定获得蛋白质最ZUI适宜的缓冲液条件、蛋白质的长期储存稳定性等。另外在进行蛋白质-配体小分子相互作用研究时，因为需要筛选的小分子配体数量巨大，因此也急需一种技术手段或设备，可以高通量的对配体结合进行筛选。

多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16应用涵盖植物、生物学、动物科学、动物医学、微生物学、工业发酵、环境科学、农业基础、蛋白质工程等多学科领域。蛋白质是最终决定功能的生物分子，其参与和影响着整个生命活动过程。现代分子生物学、环境科学、动医动科、农业基础等多种学科研究的很多方向都涉及蛋白质功能研究，以及其下游的各种生物物理、生物化学方法分析，提供稳定的蛋白质样品是所有蛋白质研究的先决条件。因此多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16在各学科的研究中都有重要的意义。

蛋白质Tm值测定具有重要的实际应用价值，例如辅助生物药物开发、生产和质量控制，评估生物相似性、优化蛋白药物配方等，还可以作为探索蛋白质高级结构的手段之一指导蛋白质工程，如比较不同突变对蛋白质稳定性的影响，研究结构域改变与功能活性改变关联性等。比较不同Tm值测定方法，全面了解技术特点及测量效果对于Tm值测定的实际应用具有一定的指导意义，在科研或生产工作中可以灵活选用或联用多种技术来阐明不同条件下的结构变化特点。具体包括以下几个月几个应用领域：

1.    抗体：抗体作为最主要的蛋白类制品，其稳定性研究至关重要，而且主要集中在上游阶段。在上游的抗体发现阶段，需要从众多候选抗体中筛选出少量的候选抗体转移到下游，传统测定的指标主要有表达量和结合能力（亲和力，结合动力学）等，而抗体的热稳定性也是一个非常重要的补充指标。在完成抗体发现后，需要研究抗体在什么buffer条件下具有更好的成药性（粘度合适，渗透压合适，长期储存稳定等），其中抗体的热稳定性是一个重要的判断指标。

2.    酶制剂：酶作为另一类重要的蛋白制品，对其稳定性的考察也非常重要。工业酶的工作环境非常苛刻，温度高，酸碱条件苛刻，某些发酵产物本身也会降低蛋白活性（例如产乙醇酶需要耐受高浓度的乙醇），因此需要对酶进行大量的筛选和改造，以获得活性更高，耐受性更好的酶。通过测定不同候选酶突变体的热稳定性，以及酶在不同条件下（例如添加不同浓度的乙醇）的热稳定性，可以非常迅速有效的进行酶的质量的评价。

3.    疫苗：灭活疫苗和重组蛋白疫苗，都是蛋白制品。重组蛋白疫苗和抗体非常类似，都是通过外源重组表达的方式获得蛋白，因此蛋白稳定性分析的应用点也类似，主要集中在上游的蛋白发现和蛋白制剂阶段。而灭活疫苗略有不同，灭活疫苗的产品是病毒颗粒，只有完整的病毒颗粒才具有好的免疫源性。热稳定性分析可以测定颗粒打破和单个蛋白变性这两个阶段，因此可以应用到制剂开发和下游的质量控制环节。不仅在人用疫苗中有应用，兽用疫苗企业也同样有应用。

4.    化合物药物：小分子药物的作用靶点多数是蛋白。在小分子药物筛选中，有一个实验叫做Thermal shift assay（TSA），通过检测蛋白结合小分子前后的热稳定性变化，来判断是否发生了结合。因此在化合物药物企业中，可以推TSA实验这个应用点。同时热稳定性也可以作为靶点蛋白质量控制的手段，检查蛋白是否有活性。

 

 

 

 

实际案例：

多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16推出市场后，在短短时间内测试过各种不同类型的样本，在多个客户实验室进行现场DEMO，数据显示测试结果良好，重复性优异，相关参数达到甚至超过国外同类产品的水平。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

北京佰司特科技有限责任公司 (https://www.best-sciences.com)

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