前沿进展：通过微生理方法解决药物研发的难题—t4 Workshop Report（三）

t4 Workshop Report-跨大西洋毒理学智库的报告，该智库由Doerenkamp Zbinden基金会赞助，由巴尔的摩、康斯坦茨和乌得勒支的毒理学负责人合作完成。本文所表达的观点是作者本人的观点，不一定代表他们的工作机构的观点。

May 15, 2016

翻译和整理：北京佰司特科技有限责任公司

最近出现的微生理系统——在体外模仿人体组织、器官和循环生物学的微流控仿生装置——被认为是可能彻底改变如今的药物开发模式。一项近期由美国政府倡议并在欧洲和亚洲开展的研究项目，最近获得了第一个前沿成果：基于微生理系统的人的单器官和多器官工程，在此基础上建立的测试系统有望模拟不同的疾病阶段，并在临床试验之前预测毒性、免疫原性、ADME谱和治疗效果。这一技术将对药物发展的未来产生重大影响。此外，基于微生理系统的分析可能会彻底改变我们当前的模式，对任何新物质（例如用于农业、食品、生态系统或化妆品）的危害进行排序，从而取代目前使用的实验动物模型。来自学术界、工业界和监管机构的36位专家在德国柏林举办了一个集中研讨会（2015年6月），回顾了目前微生理系统的现状，并评估了药物开发周期中广泛的、具有潜力的方法，提出了可行的技术解决方案，建立人的体外生物学的更高水平的技术。此外，会议重点介绍了器官芯片的重要的案例，以及各种国家和国际项目。最后，概述了未来的路线图，允许在全球范围内进行更具预测性和监管认可的物质检测的方法。

3. Industries test standards, unmet needs and potential for MPS adoption (翻译和整理：北京佰司特贸易有限责任公司)

行业测试标准、未满足的需求和采用 MPS 的潜力 (翻译和整理：北京佰司特贸易有限责任公司)

尽管只有少数年轻公司，例如AIM Biotech、Bionas、cellasys、CN Bio Innovations、Emulate、Hesperos、Hµrel、InSphero、Kirkstall、micronit、Mimetas 和 TissUse，提供 MPS 设备，它们已经足够先进，可以为可行性研究提供探索性平台。制药和化妆品行业的某些成员已经在研究使用 MPS 进行潜在危险识别以及安全性和有效性测试。研讨会专家的常识是，目前没有任何一种基于 MPS 的方法和工具被行业采用。在本章中，我们报告了关于制药、化学/化妆品和烟草行业现行物质测试标准的研讨会讨论和随后调查的结果。在此信息的基础上，来自各个行业领域的专家总结了该领域未满足的需求。最后， 本章重点介绍了行业中需求驱动的行业采用基于 MPS 的相关方法的潜在方向。

3.1 制药行业——测试标准和采用 MPS 的潜力

3.1.1药物安全评估的各个方面

药物安全性评估是一个不断发展的过程，它考虑了历史数据和新发现，以及当局不断变化的法规以及新的实验和技术能力。今天的药物安全评估涵盖大量计算机、体外和体内工具，旨在选择和优化人类安全给药的最佳候选药物。在很大程度上，这些测试的一部分需要获得监管机构的批准，而正在进行的许多额外测试用于内部决策和对不利影响的机械理解。所需的测试包括，例如，通过 MNT（微核测试）或 AMES（Bruce Ames' 测试）评估遗传毒性潜力，指示心律失常风险（尖端扭转型室性心动过速，通过测量人体醚-a 的抑制来评估） -go-go相关基因通道）或药物-药物的估计使用体外测定法在肝脏中的相互作用潜力。在体内水平上，预期在啮齿动物和非啮齿动物物种中定量显示毒性靶器官、毒性类型、血浆暴露以及分布和排泄模式，同时考虑可比较的治疗持续时间将作为进入人体试验的一揽子计划的一部分进行展示。这些只是几个例子，要求会根据药物形式的类型（小分子、肽、大分子等）、给药方式（口服、吸入）、疾病适应症和特定领域的现有知识而有所不同。也就是说，药物安全评估是一个迭代过程，后续学习取决于阶段，但是，测试的范围可能有很大差异——从最小的测试数据到包括所有可能的筛选、研究或接受测试的大包。

尽管不断改进，但药物项目在临床前和临床阶段仍存在失败（例如 Arrowsmith 和 Miller，2013 年）。在临床前阶段停止的药物项目通常面临不可接受的、急性或严重的毒性、暴露不相容性或类似类型的影响等问题，这将使成功开发药物的可能性不大。正如本报告第 1 章所强调的，I 期临床试验候选药物成功率的行业基准为 48-64%，表明与安全相关的候选药物失败的比例仍然很大（Cook 等人，2014 年：Hay 等人， 2014）。

心脏和肝脏毒性是导致这些停药的主要原因，其次是肾脏毒性。因此，仍然需要开发在接近体内环境中模拟这些人体器官的体外系统。在这里，基于 MPS 的单器官系统可能有助于在数周内重复剂量物质测试的长期体外稳定性。现有的基于 MPS 的肝脏、神经元、心脏或肾脏系统的显着改进将是可取的。为了便于工业采用，我们建议为每个基于芯片的单一器官等效物生成生物学基线。

例如，因此，基于 MPS 的肝脏系统有必要根据组织学、基因表达分析、蛋白质水平（如白蛋白分泌）来确定基于芯片的肝脏与体内肝脏的结构和功能相关性， CYP450（特别是选定的蛋白质活性，例如 CYPs 1A、CYP2C 和 CYP3A）ATP、GSH、LDH、AST、ALT 和代谢物分析。我们进一步建议生成早期和晚期时间点的广泛时间进程，并将其与标准肝细胞培养的数据进行比较。下一步，应通过基于芯片的肝脏等效物评估众所周知的肝毒性物质，以证明与静态肝细胞模型相比，可以在组织水平上获得更多数据。我们建议使用早期和晚期时间点，并在可能的情况下使用药理学相关剂量进行评估。 报告的基于 MPS 的肝脏模型的改进将是胆汁与长期培养物的分离和免疫活性细胞的整合，例如枯否细胞。这种单器官MPS的改进方案可以普遍应用于其他人体器官模型。

制药安全测试的另一个重要附加值可能是第 2.3.3 章中介绍的肝脏+X 双器官系统的鉴定和验证。这样的器官安排可能会导致可靠的检测，允许从非临床管道中消除候选物，这些候选物本身没有毒性，但通过其肝脏代谢物产生毒性。最后，生物药物的免疫原性评估是另一个未满足的安全需求。管道中的大多数大生物分子都来自人类。这使得在动物中对此类候选物进行免疫原性测试已经过时。能够预测候选者免疫原性的人体免疫器官培养正在开发中，但尚未在工业上采用（Giese 和 Marx，2014）。 MPS 方法可以在此类测试工具的建立中发挥主导作用。

药物安全评估领域的一大挑战是药物引起的个体器官异质性损伤，例如肝脏，基于一小部分患者的遗传倾向和给定药物的特性。

诱导此类毒性的药物通常在临床阶段后期或上市批准后失效。在许多情况下，如果无法完全阐明机制，该计划就会停止，尽管只有极少数患者表现出毒性。这些影响通常是由于来自药物的潜在责任而产生的，在正常情况下，这种责任不会变得明显，并且是患者衍生的因素（遗传易感性，疾病特异性）。只有当这两个方面同时发生时，才会产生毒性。这种所谓的特殊类型的临床毒性构成了重大挑战，因为如果机制未知，则需要对来自数万名不同供体的数万个基于 MPS 的组织模型进行测试，以获得统计机会来识别在人类接触药物之前处于危险中的人类亚群。

然而，已发现一些异质药物诱导的肝脏机制依赖于特定的 HLA 类型，并且可能依赖于适应性免疫系统的特定因素。对于这些情况，开发基于 MPS 的高效筛选平台可能值得尝试。此外，据报道，将多组织系统扩展到在生理上将肠和肾脏等效物与肝脏等效物排列在芯片上的系统，可能会促成多组织肝脏等效物的新应用——生成 ADME 数据和 PK/PD 分析在一个实验环境中，提供的药物摄取、分布和排泄的定量方面可以在体外概括。前面提到的所有理想的 MPS 开发都可以在筛选策略和机械研究中实施。

在体外工作时还有其他主要的基本挑战；一个是缺乏从体外效应到体内效应的定量转换。例如，化妆品和化学工业在努力寻找全身毒性研究的替代方案时产生的研究 AoP 的概念不能真正与为临床药物确定的定义“未观察到的不良反应水平”的概念联系起来发展：如果我们不知道人体的动力学参数，10 µM 的毒性作用对临床的 AoP 意味着什么？例如，药物可能在人体中的暴露、代谢、分布和消除情况如何？因此，关于 AoP 的信息可能无法直接用于必须定义剂量的体内情况。此外，在应用体外试验时，在药物开发的早期阶段通常无法获得此类定量估计， 这使得关于体外标志相关性的坚定声明变得困难。有历史数据可以验证其中一些端点，但不是所有需要的端点，历史数据集的一个缺点是化学空间，例如，1970 年的药物开发可能与 2016 年的非常不同。因此，基于 MPS 的测定，模拟人体多器官排列与生理血流和按比例缩小的参数，匹配患者的基本生理原理，非常适合药物安全测试。

3.1.2 测试标准、未满足的需求和功效测试的新方法

候选药物的功效在药物开发周期中进行评估。药物不再因不良的物理化学或药代动力学特性而在临床上失败。相反，失败的一个主要原因是缺乏疗效。实验室动物的体内功效和活性测试是临床前阶段的主要基石和要求。这些测试伴随着体外生物测定，例如靶标结合和效力测定。来自四家大型制药公司的口服小分子的损耗汇编显示，由于疗效问题，此类化合物在 II 期的损耗率为 35%（Waring 等人，2015 年）。因此，II 期试验中的这种流失率表明在候选药物的功效和 MoA 的临床前研究中获得的知识有限。药物发现中追求的大多数目标的临床相关性通常不完全清楚。自 20 世纪 70 年代后期理性设计理念问世以来， 大多数药物研发筛选项目的重点一直放在单一药物靶点上，这些靶点通常是似乎在疾病发病机制中起作用的蛋白质。基于目标的筛选平台也非常适合高通量筛选策略，通常可以找到非常有效和选择性的化合物，并且可以应用特定的化学和分子知识来修饰化学实体。然而，低成功率表明需要替代的临床前策略，重点关注相关的生物学途径及其临床相关性。 Swinney 和 Anthony (2011) 分析了研发的生产力，尤其是 1999 年至 2008 年间美国 FDA 批准的包括新分子实体和新生物制剂在内的创新药物。获得批准的大多数一流小分子主要来自来自动物模型的表型筛选，而不是基于目标的方法， 那是在一个主要关注以目标为中心的方法的时代。使用单一受体/蛋白质的还原论筛选策略经常失败的一个主要原因可能是大多数疾病是多因素事件，对许多器官有系统性影响，因此，需要在完整器官及其水平上观察反应在正确的病理生理背景下与其他器官相互作用。

因此，迫切需要开发临床前检测，以更有效地转化为特定疾病患者的临床效果。代谢综合征是多因素和多器官疾病的一个很好的例子，它收集了许多与心血管疾病和糖尿病相关的风险。代谢综合征正变得越来越普遍，这主要是由于肥胖患病率增加所致。它是一种隐匿和进行性疾病，可最终导致 2 型糖尿病，它具有患心血管疾病的高风险，并且在患有慢性肾脏疾病的患者中也很普遍。没有经过批准的药物可以可靠地降低所有代谢危险因素。为避免多重用药问题，这些患者将通过单一疗法获得针对多个或所有风险因素的药物。

由于现场动物模型的预测能力低，迫切需要一种对代谢综合征等疾病有用的人类相关临床前基于 MPS 的多器官模型（Aleixandre de Artinino 和 Miguel Castro，2009）。它需要结合关键器官，如胰腺、肝脏、脂肪、肌肉血管和肾脏。在这样的模型中，可以研究疾病从腹部肥胖和胰岛素抵抗发展为 2 型糖尿病和糖尿病并发症的关键步骤。该模型可以由健康组织建立，在健康组织中可以通过例如培养基、营养或激素操作来研究代谢紊乱的进展。另一种策略是使用来自患病受试者的组织或细胞。这种模型可用于揭示新的生物学途径和靶点及其在模型中疾病进展的各个阶段的临床相关性。 药物开发中微生理系统的最终目标是概括疾病的各个阶段，甚至了解疾病临床表现之前的阶段，这可能为新的治疗范式开辟道路。

如果选择了特定目标，则候选药物的优化可以包括基于目标的筛选。在这种情况下，优化的化合物可以在疾病模型中研究治疗效果。最终，可以在疾病模型和体外剂量探索研究中评估所选化合物，以指导临床计划。该策略整合了早期药物发现和转化发现。除了疾病相关模型中的治疗效果外，基于 MPS 的模型还可用于研究有用的体内治疗生物标志物。

多器官模型可以使用来自患病个体的材料，也可以在系统中诱发疾病。通过使用最新的多参数读出技术和生物信息学，可以研究疾病发病机制并揭示生物网络。在分子水平上对疾病病理学的洞察可以表明是否需要单一目标方法或追求多个目标的更复杂策略。生物信息学和传统结构生物学工具与化学信息学和计算分析相结合可以指导干预的选择，并有助于确定通路扰动所需的化学类型。图 14 描述了一个可能的以患者为中心的药物发现模型的示意图，该模型使用 MOC 作为焦点来评估干预策略、评估目标和剂量设置。

图14：基于mps的模型对药物发现筛选策略的影响提出了一个如何通过包括疾病模拟多器官系统方法和工具来改变药物发现筛选策略的模型。该模型可用于分析和揭示疾病机制，并确定治疗干预措施。

在当前的候选药物新药评估中，高级多器官 MPS 的另一个重要机会是在肿瘤学领域进行联合毒性和疗效测试。在确定了一个有价值的癌症靶标后，化合物库将筛选出该靶标的抑制剂（有时是激活剂）。随后，通过确定这些所谓的命中对肿瘤细胞系的抑制作用，测试已经通过该第一步的化合物的体外功效。在下一步中，将具有有希望的体外抑制潜力和可接受的药代动力学特征的化合物施用于荷瘤啮齿动物。

在这些早期阶段，可以在非癌细胞系或原代细胞培养物中研究安全性方面的问题（表 2）。这些体外毒性测定的终点相当简单，并确定持续 24 至 72 小时的短期测定中的增殖抑制，例如，在增殖角质形成细胞 (HaCaT(p)) 的培养物中或非增殖细胞中的明显细胞毒性细胞 (HaCaT(q))。经常使用原代大鼠肝细胞来反映化合物的潜在代谢。通过将肿瘤细胞系试验中获得的 EC50 与静止培养物中的细胞毒性浓度或增殖的非癌细胞中的 IC50 进行比较，这种分离的体外测试组合能够识别那些对肿瘤靶标缺乏特异性的化合物。 EC50 范围内的 IC50 清楚地表明对肿瘤靶标的特异性太低并且对健康产生不利影响， 特别是在患者的增殖组织中。化合物 2 在非增殖细胞中显示细胞毒性，浓度低于有效浓度的 10 倍，如在 HeLa 细胞中测定的那样，因此被认为是有问题的。化合物 1 对非增殖细胞，但在低于 EC50 的浓度下仍显示出抗增殖作用，并且对 HeLa 细胞也有抑制作用，即该化合物的抗增殖特异性值得怀疑。

然而，这种比较方法无法反映可能由肿瘤和健康组织之间的相互作用引起的影响，因为它发生在整个生物体中。此外，由于所描述的测试系统的短期性质，无法描述仅在长期暴露时引起的影响。

因此，希望获得一种 MPS，其中癌细胞可以作为球体培养数天甚至数周，并与一组非癌症类器官（例如肝脏、心脏、皮肤和/或肾脏）共同培养，从人类细胞或组织外植体中提取。这样的模型将允许仅在一个系统中获得功效和第一安全参数的读数。此外，它还能够反映微环境的变化，并显示药物代谢物对健康组织和癌组织的影响。从理论上讲，这种基于人体材料的模型还应在安全性和有效性方面提供更好的临床观察效果转化率。

总之，MPS 可用于制药行业，作为新化学或生物分子的功效和毒性测试的筛选工具。由此产生的测试信息可以有助于选择目标和先导结构，以及用于进一步开发的候选药物的优先级排序和选择。此类分析产生的科学信息或数据也可用于开发过程中的内部决策和指导。此外，作为机理研究的一部分，它还可以作为补充的最新科学信息附加到研究药品档案和/或研究新药申请文件中。

图 15 说明了药物开发生命周期中单器官或多器官系统的潜在应用领域。

图15：药物开发周期中各类MPS的靶段。单器官系统被设想为从目标选择到先导优化(红框)的显著价值，基于平板的系统主要服务于早期发现的高通量需求，基于芯片的系统主要服务于先导识别和早期先导优化的需求。多器官系统应该能够在先导优化后期和临床前评估早期进行预测测量(蓝框)。所有类别的MPS可能会在批准后扩展或限制特定基因型亚人群的适应症(红蓝框)中添加相关数据。纵轴表示执行测试的大致数量(灰色)和相关支出(蓝色)。横轴表示以年为单位的开发时间。

设想单器官系统以更高的通量在早期阶段增加显着价值，而多器官系统应该能够在临床前阶段后期进行预测测量。后者可以提供更系统的体内样测定，从而更容易转化治疗效果。然而，缺点是在没有目标的确切知识和较低通量提供的设计参数的情况下优化候选药物的分子特性面临挑战。尽管临床前发现和定性临床数据生成将成为基于 MPS 的工具的主要应用，但将它们用于批准后评估可能具有进一步的附加值。基于 MPS 的工具具有在早期发现和未来临床前阶段与动物模型竞争的潜力。甚至在临床开发期间，也可以在整个药物开发过程中使用来自 MPS 测试的信息。最后， 在此过程中，有关发现的机械信息可能支持临床使用。值得注意的是，只有当令人信服的数据表明基于 MPS 的工具提供了明确的附加值时，制药行业才会采用此类系统，例如，在未满足的需求领域。基于 MPS 的工具的后续验证对于整个制药行业的完全采用至关重要。本报告第 6 章提供了有关基于 MPS 的工具的验证策略的信息。

3.2  化学和化妆品行业——MPS 如何发挥作用。

化学和消费品中的物质测试，例如化妆品行业，旨在识别物质可能对人类造成的任何潜在危害。与制药行业相反，风险收益分析可能导致接受候选药物的特定药物毒性水平，如果其对患者的疗效益处超过安全性不利因素，则化学品和消费品的监管要求不会接受用于人类的物质的任何有意义的潜在危险。这些物质经常接触到皮肤。许多日常生活用品，如化妆品、家居用品、香水、挥发性有机化合物和化肥，都需要或不可避免地与皮肤接触。已经开发并验证了用于体外评估皮肤刺激、腐蚀和渗透的测试和策略。皮肤对特定成分过敏的风险，因此， 对产品的过敏反应是另一个重要的毒理学问题。对消费品的过敏反应可以通过职业性皮肤致敏、对结构相似抗原的交叉反应、成分的跨行业使用以及产品本身对客户的致敏来解释。动物测试方法，例如局部淋巴结测定（LLNA，Gerberick 等人，2007a）和豚鼠最大化测试（Basketter 和 Scholes，1992），一直是黄金标准，使风险评估人员能够识别潜在的危害和化合物的效力，后一个参数指的是足以引起皮肤过敏的浓度范围。相应的 OECD 皮肤致敏试验指南编号为 406（OECD，1992）。通过用额外的交叉阅读信息和暴露场景来补充这些信息，风险评估人员能够对最终产品中特定化合物的安全浓度做出判断。 为了最大限度地降低风险，应用默认安全系数以考虑物种间在渗透、代谢和免疫学方面的差异，以及毒性测试的固有易错性（Basketter 等人，2015 年；Dean 等人，2001 年）。

由于欧盟委员会法规 (EU) No 655/2013（EC，2013c），也称为欧洲化妆品指令（Hartung，2008），化妆品和香水行业尤其受到挑战，因此，在非化妆品和香水行业非常活跃-动物皮肤致敏评估。化学工业也在积极制定体外皮肤致敏试验策略，旨在避免因化学品注册、评估、授权和限制 (REACH) 法规而对化学品进行不必要的重新评估（Rovida 和 Hartung，2009 年；Hartung 和 Rovida， 2009).第 5.5 章详细介绍了欧盟化学品对人类风险评估的法律框架。本报告的一部分（Hartung，2010a）。在这里，我们重点介绍用于识别皮肤潜在危险的测试标准。

在皮肤致敏领域，欧洲动物试验禁令刺激了多种体外试验的发展，同时，促进了这些方法的开发和验证以获得监管认可的战略（Basketter 等人，2012 年，2015 年） ；Leist 等人，2014 年）。这一领域的活动得到欧洲化妆品协会和香料材料研究所 (RIFM) 等协会以及欧洲替代方法验证中心 (EURL-ECVAM)、机构间协调委员会等机构的智力和财政支持替代方法验证委员会 (ICCVAM)、动物试验替代方法中心 (CAAT) 和欧洲动物试验替代方法伙伴关系 (EPAA)。非动物体外皮肤致敏方法的开发得益于学术和临床研究收集的大量数据，使人们能够对复杂的致敏机制有科学见解。 OECD 于 2012 年确定并发布了皮肤致敏不良结果途径 (AoP) 中的四个关键步骤（EC，2012b）：

1) 化合物与皮肤蛋白的共价结合，2) 角质形成细胞的激活，3) 皮肤驻留的树突状细胞 (DC) 的激活和迁移至引流淋巴结，以及 4) DC 依赖性、过敏原特异性启动幼稚 T -淋巴结中的细胞，导致 T 细胞增殖和 T 记忆细胞形成。这些见解为体外方法指定了适当的目标，此外，还提到了基于 AoP 的测试策略。

迄今为止，EURL-ECVAM 在不同的正式验证阶段列出了 18 种皮肤致敏测试选项，其中大部分针对单个 AoP 事件 (https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/test-submission/ecvam-test-方法提交-2008-2015）。化妆品行业也报告了通过比较不同的检测方法来系统评估不同非动物测试选项的战略方法（Reisinger 等人，2015 年）。体外测试最近的一项重大突破是直接肽反应性测定（DPRA；Gerberick 等人，2004 年；Gerberick 等人，2007b）和 KeratinoSensTM值（Emter 等人， 2010 年；Natsch 等人，2013 年）在 2015 年。经 EURL ECVAM 认可后，OECD 发布了两种检测的测试指南（分别为 OECD TG 442C 和 OECD TG 442D）。第三种检测方法是人类细胞系激活试验（h-CLAT；Ashikaga 等人，2006 年），目前被 OECD 评为暂时接受。 这三个分析很方便地涵盖了前三个 AoP 事件； i) DPRA 评估半胱氨酸或含赖氨酸的人工肽的半抗原化； ii) KeratinoSensTM值基于 HaCat 细胞中 ARE 启动子驱动的荧光素酶报告基因表达分析 Nrf2 依赖性应激反应，以及 iii) hCLAT 分析树突样细胞系 THP-1 的激活基于CD54 和 CD86 共刺激细胞表面标志物的诱导。表 3 中提供了集成测试策略的示例。

尽管 DPRA、KeratinoSensTM 和 h-CLAT 在验证方面可能领先，但方法开发人员正在积极推进针对类似终点的其他替代检测。 PPRA 可能会将部分代谢引入肽反应性评估中，以改善前半抗原的化学评估（Gerberick 等人，2009 年），而 LuSens 分析（Ramirez 等人，2014 年）和其他 Nrf-2-报告细胞系-基于化验的检测提供了 KeratinoSensTM 测试的替代方案。关于 DC 激活，除了 h-CLAT 之外，还有几个测试存在，最突出的是髓样 U937 皮肤致敏试验（U-SENS，以前称为“MUSST”测定，Ade 等人，2006 年），修改后的髓样 U937 皮肤致敏试验MUSST 检测和 PBMDC（Reuter 等人，2011 年）。尽管付出了巨大努力，但第四个 AoP 关键事件的分析开发仍未解决。最近发表了朝着基于 T 细胞的检测迈出的第一个有希望的步骤（Richter 等人，2013 年）。然而， 淋巴结中复杂的“器官反应”，其中来自外周的活化树突细胞将半抗原化肽呈递给幼稚 T 细胞，从而启动抗原特异性和皮肤归巢 T 效应器和 T 记忆细胞的生物学重要增殖是难以模仿的在体外使用基于悬浮细胞的测试设计。

人们普遍认为，AoP 对齐测试的结果比排他性更具互补性（Basketter 等人，2015 年）。然而，测试结果的解释具有挑战性，对透明和可重复决策框架的需求刺激了综合测试策略（ITS，Hartung 等人，2013b）和测试和评估综合方法（IATAs，Tollefsen 等人， 2014 年；Bal-Price 等人，2015 年）。这些策略最近在关于安全评估综合测试策略的 t4报告中进行了审查（Rovida 等人，2015b）。根据 Jaworska 和 Hoffmann 的明确解释，ITS 代表了一个指导框架，用于通过涵盖相关机械步骤的合理和合乎逻辑的测试组合来生成全面的、非冗余的体外数据（Jaworska 和 Hoffmann，2010 年； Jaworska 等人，2010 年；Luechtefeld 等人，2015 年）。为了优化风险评估， ITS 方法生成的综合数据应根据经过全面评估的决策方案进行解释，并应考虑单一化验的适用范围以及化验结果的一致性，特别是如果 ITS 包含具有部分机械重叠的化验。

IATA 通过战略性地整合和权衡所有相关数据来扩展 ITS 的概念，以便为有关潜在危害和/或风险的监管决策和/或进一步有针对性的和因此最少的测试的需求提供信息（Barroso，2014 年）。

IATA 的信息来源不仅限于体外结果，还包括物理化学数据、计算机预测和证据权重考虑。已经开发了几种皮肤致敏 IATA，通常基于 AoP 关键事件分析的组合，这些分析通过其他分析得到丰富，例如用于表面硫醇浓度和毒物基因组学。在 EPAA 和欧洲化妆品协会最近组织的一次研讨会上，介绍并讨论了六个 IATA。 ITS 和 IATA 方法生成高度复杂的数据。务实的方法，例如 2-of-3 概念（Bauch 等人，2012 年）取得了可喜的成果。机器学习系统，如贝叶斯模型、人工神经网络和支持向量机，被证明是为特定化合物的危害（和部分效力）信息建立预测模型的有价值的工具（Hirota 等人，2013 年；Jaworska 等人，2013 年）。 ，2015 年；Tsujita-Inoue 等人，2015 年）。此外， 这些系统能够凭借扩展的训练集轻松地改进和改进预测参数。但是，需要注意的是

计算模型中隐藏层的“黑匣子”特征无法为随后的风险评估提供机制见解。

尽管目前用于预测皮肤致敏性的 IATA 案例研究看起来很有希望，但用于效力预测的定量方法最近才开始受到关注。效力测定是风险评估的基石，并且仍然是大多数非动物皮肤致敏评估策略的主要差距。虽然存在旨在提供效力信息的单一检测，例如，基于毒物基因组的基因组过敏原快速检测测试（GARD；Johansson 等人，2013 年）和 Sens-Is 检测（Cottrez 等人，2015 年），但 IATA 方法是现在也即将对测试化合物的效力进行分类。

MatTek Epiderm、Phenion 和 Episkin 等三维皮肤模型已被证明是用于毒性测试的有价值的工具，并且在最近关于上皮屏障（皮肤、肠道和肠道）非动物模型的 t4报告中得到了广泛的审查Lung) 在研究、工业应用和监管毒理学方面的研究（Gordon 等人，2015 年）。

在某些情况下，皮肤模型的特征显示与体内皮肤代谢高度相似。尽管困难重重，但在创建具有免疫能力的皮肤模型方面已经取得了进展。同时，据报道，基于 HaCat 细胞和 DC 共培养物的皮肤致敏试验显示出对前半抗原的敏感性增加，这可以通过代谢增加来解释容量。最近的出版物报告了树突状 Mutz-3 细胞成功整合到皮肤模型中（Ouwehand 等人，2011 年）并显示了对刺激物和致敏剂的反应（Kosten 等人，2015 年）。

总之，过去几年在体外皮肤致敏评估领域取得了可喜的进展。当前 ITS 和 IATA 的危险预测参数与金标准 LLNA 相当，甚至优于金标准。基于 AoP 的 ITS 和 IATA 策略将动物测试的生物学复杂性拆分为可执行的测试部分。然而，相应的信息片段需要通过复杂的计算模型进行组装。此外，基于细胞培养的检测的适用性通常会受到化合物溶解度和应用形式的限制。只有少数皮肤致敏试验是基于可以处理水不溶性化合物或制剂的皮肤模型。此外，测试系统的代谢能力对于前半抗原的检测很重要，需要考虑结果的解释。

MPS 用于危害识别和毒性测试的潜力已得到消费品行业的认可，目前正在进行首批可行性研究，以评估各行业采用 MPS 的潜在途径。 MPS 可以通过将上述四个生物学和 AoP 相关的关键事件和多个读数集成到一个具有免疫活性的皮肤 MPS 中来促进综合测试方法。皮肤外植体或 3D 皮肤模型适用于化合物的局部应用，例如化妆品配方。此外，他们会（部分地）添加直接影响化合物皮肤致敏作用的生物利用度参数。致敏化合物的皮肤渗透可能不仅受分子量和溶解度的影响，而且还受其化学反应性的影响，这可能导致化合物被例如角质层蛋白吸收。 在第 2.3 章中描述的微流体 MOC 平台中结合初级 DC 和表皮模型的第一种方法。进行并揭示了需要调整的参数，以便将来成功整合两种细胞类型（未发表的数据）。

迈向集成所有相关参数的 MPS 方法的进一步步骤是将具有免疫活性的人体皮肤模型与双器官芯片中的人体淋巴结相结合。这样的系统可能允许检测和量化淋巴结对局部应用的化学物质的反应，这在某种程度上反映了 LLNA 的读数，LLNA 是行业中基于动物的黄金标准。这种 MPS 方法与包含多种测定的测试策略相比还有另一个优势。化验的组合以假阳性结果为代价提高了整体灵敏度。

假阳性结果不仅使不一致结果的解释复杂化，而且使上一代计算预测模型复杂化。

除了皮肤致敏测试外，化学品测试领域还使用了广泛的毒性测试，同样，历史上主要基于实验室动物测试。有可能应用体外方法，但尚无公认的替代方法可用于研究全身毒性（例如急性毒性、重复剂量毒性和生殖毒性）。这是欧洲化妆品领域另一个未被满足的需求，欧洲已全面禁止动物试验。迄今为止，还没有任何完全基于替代方法的化妆品上市申请。毋庸置疑，对可以接受监管使用的全身毒性测试替代方法的需求很大。

急性毒性试验侧重于生物体死亡，传统静态体外试验无法轻易模拟这种效应，因为它可能涉及单一器官衰竭以及器官之间的相互作用。目前取代急性毒性试验的努力包括使用细胞系进行体外细胞毒性试验，例如 3T3 NRU 细胞毒性试验，这需要与动力学数据和体外靶器官试验相辅相成（Prieto 等人，2013 年）。改进的目标器官模型，如 MPS 模型，其中也可以分析细胞毒性，可以提高这些体外试验对急性毒性的预测价值。 MPS 显着改善动力学测量和全身毒性测试的潜力，如第 3.1 章所述。用于药品安全性评估的方法一般同样适用于化学品和化妆品的潜在危险性测试。因此，第 2.3 章中描述的 MPS 工具。用于动力学（例如肠道芯片； gut+liver-on-a-chip 和 gut+liver+skin+kidney-on-a-chip) 被设想为动力学终点增加价值，因为不同的动力学过程被合理地分开，每个过程都有不同的器官。根据第 5.5 章的表 3，虽然对动力学数据的监管需求似乎并不大。在本报告中，当对危险终点进行体外试验时，动力学数据的添加与体外试验或策略相结合变得必不可少。原因是动力学包括在整个动物试验中，但不包括在只有一小部分生物体的试验中，例如体外试验。因此，必须将动力学数据添加到体外危险测试的结果中，以使该结果更能预测体内反应。如上所述，建议将基于 MPS 的测试系统与基于生理学的毒代动力学模型相结合。这些模型理想地允许估计不同组织和器官中的局部物质和代谢物浓度。 因此，结合给定的暴露，他们可以潜在地识别目标器官以及相关器官剂量，以便进行后续的体外测试。

然而，关于这种“毒物测试假人”的适用性和可靠性方面的经验很少（Tralau 等人，2012 年）。此外，有关所需物质吸收、分布和代谢的数据通常不可用（Caldwell 等人，2012 年）。因此，在任何常规使用之前，有必要对已确定和已评估的物质进行盲法试验研究。

最后，在至少 4 周的时间范围内，结合人体肠道、肝脏、皮肤和肾脏等效物的 MOC 实现了稳定的功能稳态（Maschmeyer 等人，2015b），为基于 MPS 的 28 天重复剂量测试开启了可能性，这经过改进和验证后，可能会与根据 OECD 指南 407、410、412 和 419 在适当情况下使用的黄金标准动物试验竞争。与动物试验相比，MPS 的人类起源提供了额外的竞争优势。当与将早期生化效应与临床结果联系起来的 AoP 和可以推断累积剂量的动力学模型结合使用时，在 MPS 中看到的反应可以预测长期暴露后的最终毒理学终点。然而，根据 OECD 准则 408、411，对动物进行某些毒性评估所需的 4 周培养和 90 天重复剂量试验或 1 年或 2 年动物试验之间的差异， 413 和 453，分别在没有禁令的地区和细分市场中，仍然是 MPS 需要克服的重大技术挑战。

总之，基于 MPS 的高级免疫活性人体皮肤模型及其与人体淋巴结的结合可以为化学和化妆品行业的潜在危险识别和效力评估带来非凡的附加值。此外，人类 MOC 能够在 28 天或更长时间内实现稳定的生理器官稳态和人体器官通用组合的串扰，可以成熟为预测全身急性和重复剂量毒性测试的有价值的方法。与制药行业相比，合格的检测可以立即改进药物开发过程和内部决策，化学和化妆品行业采用基于 MPS 的检测需要在完全工业采用之前进行更多的正式验证工作。

本报告第 6 章提供了有关基于 MPS 的工具的验证策略的信息。

3.3  烟草业、人体呼吸系统和 MPS 方法

事实证明，烟草烟雾对人类呼吸系统具有很高的危害潜力，因此烟草行业面临着显着提高其产品组合安全性的巨大压力。美国 FDA 烟草产品中心 (CTP) 成立于 2009 年，当时《家庭吸烟预防和烟草控制法》授权 FDA 监管卷烟和无烟烟草产品的制造、营销和分销。 FDA 建议申请人进行非临床研究，以解决烟草产品已知的临床毒性，并评估该产品与市场上其他烟草产品相比的一系列潜在毒性。非临床毒理学研究应使用足够敏感的方法来评估使用该产品与使用其他烟草产品之间的实际差异，或使用该产品与不使用烟草产品之间的实际差异。 动物模型是评估烟草烟雾对呼吸系统影响的行业标准。与人类或动物研究相关的局限性需要替代工具以符合 21 世纪毒理学框架的目标，并开发一种“将暴露和毒性信息完全整合到改善公共卫生决策的整体框架中的系统方法”（Sheldon 和 Cohen Hubel , 2009). FDA 注意到对 3R 的承诺和包含“现代化毒理学”作为要解决的优先领域之一（FDA，2011a），因此表示有兴趣学习可以实现其目标的当前检测方法（IMNA，2012）。

除了监管方面，该行业还努力开发新方法和工具来评估烟雾对人体呼吸系统的不利影响，这是出于道德考虑和开发新的更安全产品的目的。烟草烟雾的主要作用是针对肺部的气道和肺泡。在研究、工业应用和监管毒理学中关于上皮屏障（皮肤、肠道和肺）非动物模型的 t4报告中提供了对体外肺模型的全面近期审查（Gordon 等人，2015 年） . Manuppello 和 Sullivan（2015 年）最近的另一篇评论特别强调了体外评估烟草产品的技术进步，包括促进暴露于气液界面 (ALI) 以测试烟草烟雾毒性的重组人肺组织培养物, 电子烟气溶胶、成分和微粒。 来自工业界和学术界的专家团体以及监管利益相关者目前正在努力解决与新体外毒性测试方法的方法和终点标准化有关的挑战。关于烟草产品潜在改良风险的评估，应尽量减少动物使用，并应根据基于人体细胞的体外系统获取机械数据，这些系统有可能更快地提供特定的、可操作的和与人类相关的见解。

研究吸入毒物对人体气道上皮细胞生物学影响的现有体外模型目前基于 2D 或 3D 细胞培养系统。使用上皮细胞系进行体外毒性研究的一些缺点包括有限的代谢能力，这可能会影响它们对毒性刺激的反应（Garcia-Canton 等人，2013 年），以及紧密连接的形成或耐火性的缺失或减少分化 (Stewart et al., 2012)。 3D 培养系统是描述当前使用的吸入毒物影响的最合适的体外模型之一，其中完全分化的原代上皮细胞在 ALI 中生长。该模型系统具有在人类气道中发现的假复层上皮细胞的完整细胞复杂性，包含纤毛/非纤毛上皮细胞和基底（祖细胞）细胞（Prytherch 等人，2011）。此外，它最类似于顶端粘液分泌的上皮功能， 离子通道的表达和紧密连接的存在，这保证了生物屏障功能（BéruBé 等人，2009 年）。尽管 3D 细胞培养物与天然组织非常相似，但它们通常缺乏免疫系统的细胞成分；许多共培养系统正在解决这一差距，这些系统将免疫细胞与上皮细胞层的共培养以及利用 ALI 条件相结合（Klein 等人，2013 年）。包含三种细胞类型的静态系统：上皮细胞、人血单核细胞来源的巨噬细胞和 DC 被设计为肺泡壁的体外模型，以检查这些细胞对环境颗粒的生理反应（Lehmann 等人，2011 年；Rothen -Rutishauser 等人，2008 年）。它用于检查表面活性剂蛋白 D 在调节过敏原颗粒摄取和炎症反应中的作用（Schleh 等人，2012 年），以及金纳米颗粒的生理效应和摄取（Brandenberger 等人， 2010）。在这些系统中，研究人员使用了 A549 细胞，这是一种可能不能代表健康上皮细胞的肺腺癌细胞系。

烟草业迫切需要解决调查肺部疾病发作的方法。吸烟会诱发慢性阻塞性肺病 (COPD)，并且在美国 10 例与 COPD 相关的死亡中有 8 例是吸烟造成的（DHHS，2014 年）。标题 COPD 指的是一组导致气流阻塞和呼吸相关问题的疾病：COPD 包括肺气肿、慢性支气管炎，在某些情况下还包括哮喘。对于 COPD，由于肺泡破坏、气道炎症、气道粘液排泄增加以及肺组织伸展和收缩能力丧失，流经气道的空气减少。在上述静态体外肺模型中，模拟人肺的这种复杂行为是不可能的。基于 MPS 的片上肺模型系统，在第 2.2 章中有详细概述。本报告的其他方面类似于人类呼吸道的其他方面，例如呼吸的机械生物学（Huh 等人，2010 年；Stucki 等人，2015 年），并且， 因此，提供了很好的机会来模拟 COPD 的各个方面，研究毒性引起的肺损伤和暴露于烟雾后的修复。如第 2.2 章所述。已经在芯片上小气道模型的基础上开发了化疗引起的肺水肿模型（Benam 等人，2015b）。作者们

建立了人肺“片上小气道”，其中包含分化的粘液纤毛细支气管上皮和经历流体流动的底层微血管内皮，允许在体外分析器官水平的肺病理生理学，培养时间为 4 至 6 周。上皮细胞暴露于白细胞介素 13 可重建杯状细胞增生、细胞因子分泌过多和哮喘患者的纤毛功能下降。内衬慢性阻塞性肺疾病患者上皮细胞的小气道芯片概括了该疾病的特征，例如选择性细胞因子分泌过多、嗜中性粒细胞募集增加以及暴露于病毒和细菌感染导致的临床恶化。改进这种针对烟雾引起的肺水肿的模型可能是烟草业采用基于 MPS 的检测方法的一种途径。烟雾诱发疾病发作的另一个方面是恶变。第一个单器官 MPS 的开发重点是烟草引起的支气管上皮细胞的恶性转化（Li 等人，2014b）。 与动物模型相比，单器官 MPS 已被用于研究巨噬细胞在促进苯并芘 (BaP) 诱导的人支气管上皮细胞恶性转化中的作用。 MPS数据显示，巨噬细胞促进BaP诱导的人支气管上皮细胞恶性转化，这是通过核因子（NF）-κB和STAT3途径介导的，诱导细胞增殖、芯片培养中的集落形成和裸鼠的致瘤性。阻断白细胞介素 6 或肿瘤坏死因子 α 信号传导或抑制 NF-κB、STAT3 或细胞周期蛋白 D1 表达可消除巨噬细胞对肺气道芯片恶性转化的影响，这与在动物中进行的类似诱导实验中获得的结果一致。这表明基于 MPS 的肺模型能够模拟人类 COPD 进展中涉及的关键分子事件。 这使得基于 MPS 的肺模型成为烟草业工业采用的有吸引力的目标。

最后，人类肺部慢性阻塞性和恶性疾病的发生与整个机体稳态密切相关。肝脏吸收烟雾诱导的物质、基于淋巴结的对诱导肿瘤细胞的免疫反应以及患病肺与心血管系统的相互作用需要更复杂的多器官系统。 MOC 为系统性肺+X（例如 X = 肝脏或淋巴结）芯片化验提供工具的潜力引起了业界的高度关注。烟草业采用基于 MPS 的检测需要强大的资格，但还不需要监管机构的认可。基于 MPS 的增值工具和方法一旦合格，可立即用于产品开发的内部决策。

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