文献转载：中检院再发新文，肠-肝类器官串联共培养研究药物吸收和毒性过程

文献转载：在微生理系统中的肝脏毒性评估：模拟过量对乙酰氨基酚在肠-肝脏芯片上的药物吸收和毒性过程

Hepatotoxic assessment in a microphysiological system: Simulation of the drug absorption and toxic process after an overdosed acetaminophen on intestinal-liver-on-chip

翻译整理：北京佰司特科技有限责任公司

 

  为了弥补动物模型的局限性，提出了新的药物安全性评估模型，以完善和减少现有的模型。为了在体外肠-肝脏的微生理系统（MPS）中模拟药物的吸收和代谢，并预测药代动力学和毒性效应，中国食品药品检定研究院安全评价研究所（国家药物安全评价监测中心），中国医学科学院 & 北京协和医学院，德国TissUse GmbH公司的科学家一起合作，建立了一个肠-肝脏串联培养芯片，检测了APAP（对乙酰氨基酚）过量后的急性肝脏损伤过程，并于2024年9月发表于《Food and Chemical Toxicology​》杂志。

使用 Caco-2 和 HT29-MTX-E12 细胞系建立了肠类器官，同时利用 HepG2、HUVEC-T1 和经 PMA 诱导的 THP-1 以及人类肝脏星状细胞建立了肝脏类器官。使用高效液相色谱法测定 APAP 浓度，并使用 Phoenix 软件通过非房室分析法拟合药代动力学参数。肝脏损伤生物标志物天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶的变化，以及肝脏功能标志物白蛋白表明，这两个器官芯片模型在 4 天内的短期培养是稳定的。在给药对乙酰氨基酚（APAP）后，活性氧信号增强，同时线粒体膜电位降低，caspase-3（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3）被激活，p53 信号增强，表明 APAP 过量引发了毒性反应。在肠肝脏多器官系统模型中，我们拟合了毒代动力学参数，并模拟了 APAP 过量后的肝脏毒性过程，这将有助于器官芯片在药物毒性检测中的应用。

 

 

1. 引言

药物性肝脏损伤（DILI）是药物研发的主要障碍，会导致药物撤市（2021 年；2016 年）。动物模型与人体之间的差异以及日益严格的伦理要求，使得有必要采用新的药物安全性评估模型（2014 年）。这种微生理系统（MPS），也称为“芯片上的器官”，是一种通过结合微流控、微制造和三维（3D）细胞培养构建的装置。它能够为动物模型重现生理相关的器官功能。MPS平台是一种微型化的体外生理环境（Shinohara等，2021）。

这使得能够模拟和精确控制化学梯度和生物力学力，以模拟体内环境并响应。预定义的微流控通道充当工程化的血管，重现体内生理组织功能（Low 等，2020 年），并允许与其他多器官系统联合（Kulthong 等，2020 年）。此外，多器官系统能够实现实时组织功能监测（Milani 等，2022 年）。

由微流道串联的多器官芯片模型能够进一步模拟人类动态反应和内部器官相互作用（Arakawa 等，2020 年），并为药物暴露与药物效果/毒性的关系提供辅助证据。肠和肝脏是主要的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）器官，因此在药代动力学（PK）研究中非常重要（Vernetti 等，2017 年）。

口服药物通过消化道和肠直接吸收进入血液，影响药物的生物利用度和全身剂量。肠芯片模型可以模拟药物吸收，并描绘药物的 ADME 和血药浓度（Milani 等，2022 年）。Lee 等（2017 年）建立了一个三维肠肝脏芯片来描绘对乙酰氨基酚（APAP）的药代动力学模型，而 Arakawa 等（2020 年）构建了一个肠-肝脏模型，用于三唑仑的连续代谢的体外定量推算。Milani 等（2022 年）评估了由于肠和肝脏对麦考酚酯代谢而产生的药物前体麦考酚酯的量。因此，类似的方法可以应用于其他多器官的 MPS，以研究人体内的药效学过程。

目前仅有少数关于同时进行毒性检测和样本鉴定的多器官芯片系统的例子被报道。Liu等（2020 年）基于基于肠、血管、肝脏和肾脏芯片的多器官芯片系统研究了人参皂苷复合物 K 的吸收、代谢和毒性。Jeon等（2021 年）报道了一种肠肝脏芯片，重现了脂肪酸的吸收以及随后在肝脏中的脂质积累。

为了探索体外肠-肝脏的微生理系统，在此，我们通过将肠培养物与使用四种细胞系构建的 3D 肝脏球体串联在二联器官芯片（2OC）上，开发了一种可重复的肠-肝脏的二联器官芯片。我们通过检测功能生物标志物和蛋白质的水平来剖析芯片功能，然后在芯片中通过向肠腔室添加肝脏毒性化合物对乙酰氨基酚（APAP）来测试肝脏毒性，以模拟药物吸收后的肝脏毒性。经过 48 小时的孵育，检测了两个腔室中的药物分布和肝脏毒性信号。

 

 

2. 材料和方法

2.1. 细胞与培养 细胞资源及培养方法见补充信息。

2.2. 肠的培养

为了在 Transwell 培养板上构建肠模型，以 1 ×10-6 细胞/孔的密度将 Caco-2 细胞接种到 Transwell 培养板（默克公司，PIHP01250）中。将 Caco-2 和 HT29-MTX-E12 细胞以 9:1 的比例混合，并以相同的浓度接种到每个培养板中。从第 0 天到第 7 天，每两天更换一次培养基，第 7 天之后每天更换一次。

2.3. 3D（肝脏）的培养

基于我们之前的研究（Sun 等，2024 年），THP-1 细胞在 RPMI 1640 培养基中稀释至 5 ×10-5 细胞/毫升，然后用 25 纳摩尔的佛波酯酰基乙酸（PMA，MedChemExpress）处理 48 小时，在 6 孔板中进行。随后在完全培养基中培养 24 小时并用 TryplE（Gibco）进行筛选，经 PMA 诱导的 THP-1 细胞被收集。   2   HepG2、人脐静脉内皮细胞 T1、THP-1 以及人类肝脏星状细胞（HHSC）消化后收集，细胞悬液以 60:19:15:6 的比例混合。为了形成等量细胞，稀释后每孔接种 100 个细胞到圆底 U 型低贴壁 96 孔板（深圳肝脏生物技术有限公司，LV-ULA002-96UW）中。每两天更换一半培养基。 使用高内涵细胞成像分析仪（珀金埃尔默公司，Opretta 系列）对球形形态进行了观察和测量。

2.4. 基于芯片的肠-肝脏共培养

HUMIMIC Chip2 24 孔板（德国 TissUse GmbH）是按照推荐方案（Wagner 等，2013 年）制备的。在肠模型建立后的第 14 天，将 Transwell 细胞嵌体添加到 24 孔培养室中，并将 50 个球体添加到 96 孔培养室中，以形成肠-肝脏芯片模型。

根据之前的方法（Lin 等，2020 年），在2OC 微流道循环中，使用600 ul循环培养基和 400 ul位于屏障顶部的培养基中进行共培养。

肝脏腔室中的培养基每天更换一次，并且收集并更换一半的循环上清液。在 7 天共培养结束时，使用免疫荧光法分析肝脏的器官特异性功能标志物。将片上微流泵设置为 0.8 Hz的频率。

2.5. 肠类器官的完整性

在不同时间点测量荧光素钠和 40 kDa荧光异硫氰酸荧光素 - 葡聚糖的跨内皮电阻（TEER）和肠表观通透性系数（Papp），以评估肠类器官的完整性。方法见补充信息。

2.6. 肝脏类器官的性能评估

在肝脏模型中，选择了一种灵敏的双色荧光细胞活力测定法来区分活细胞和死细胞。使用钙黄绿荧光素 AM（一种细胞可渗透染料）作为活细胞指示物，使用碘化 BOBO-3（Invitrogen 公司）作为死细胞指示物。活细胞成分在活细胞中产生强烈、均匀的绿色荧光（激发/发射 488 纳米/515 纳米），而死细胞成分主要产生细胞核红色荧光（激发/发射 570 纳米/602 纳米）。 在使用建立的肝脏器官芯片模型获得的上清液中测量了各种生物标志物。我们评估了白蛋白（ALB）、尿素（UREA）、天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）的水平，这些是肝脏代谢和损伤的指标。根据制造商的说明，使用 Cell Titor Glo 3D（Promega）测量了三磷酸腺苷（ATP）的含量。 胆酰基-赖氨酸-荧光素（CLF）是一种荧光素标记的胆汁酸，其生物学行为与天然胆酰基甘氨酸非常相似。为了在三维肝脏模型中可视化胆管，我们制备了 20 微摩尔的 CLF 储备液，并将模型在 37°C 下孵育 2 小时。用 Hoechst 33342 染色并孵育 10 分钟。细胞用无酚红培养基冲洗三次，并在激发/发射波长为 498/517 纳米处检测荧光信号。

2.7. 形态学与免疫染色

如前所述（Sun 等，2024 年），肠和肝脏的等量切片用多聚甲醛固定，并用蔗糖溶液脱水。冷冻切片在染色前先用苏木精-伊红（HE）染色、高碘酸-希夫（PAS）染色或免疫染色进行切割。对于免疫染色，切片先用 PBS 冲洗三次     用含有 0.5% Triton X-100（索尔博）的 PBS 处理细胞，处理时间及穿孔处理 10 分钟，用山羊血清（Beyotime Biotechnology）封闭 30 分钟，在室温下进行。按照说明书以一定稀释度向每个孔中加入一抗原位体，并在 4℃下孵育过夜。使用以下一抗原位体：抗 Occludin（91131S，CST，1:400 稀释度）、抗 ZO-1（ab221547，Abcam，1:100 稀释度）、抗 MRP2（ab172630，Abcam，1:500 稀释度）和抗 PGP（货号 25081-2-AP，ProteinTech，1:500 稀释度）。清洗细胞，用相应的荧光偶联二抗原位体处理，并与 DAPI（Beyotime Biotechnology）共定位。使用高内涵细胞成像分析仪或显微镜（奥林巴斯 IX71）观察明视野形态和切片。 对于原位免疫荧光染色，肠膜和 3D 肝脏模型用 PBS 冲洗三次，并用 4%多聚甲醛固定 30 分钟。接下来，样本在含有 0.5% Triton X-100（索尔博）的 PBS 中穿孔处理 10 分钟，并在室温下用山羊血清（Beyotime Biotechnology）封闭 30 分钟。 按照说明书，将稀释后的原位抗体以一定稀释度加入每个孔中，并在4℃下孵育过夜。使用的原位抗体包括：抗Occludin（91131S，CST，1:400稀释）、抗ZO-1（sc-33725，Santa Cruz Biotechnology，1:500稀释）、抗MRP2（ab172630，Abcam，1:500稀释）、抗ABCB11/BSEP（ab255605，Abcam，1:100稀释）、抗PGP（Cat No. 25081-2-AP，ProteinTech，1:500稀释）、抗CYP3A4（MA5-17064，ThermoFisher，1:1000稀释）、抗Ki67（9449S，CST，1:10,000稀释）、抗CD31（3528S，CST，1:100稀释）、抗CD68（ab213363，Abcam，1:100稀释）、抗SMA（14395-1-AP，ProteinTech，1:100稀释）、抗裂解的caspase-3（9664S，CST，1:400稀释）和抗p53（2524S，CST，1:2000稀释）。细胞经过洗涤，与荧光偶联的次级抗体孵育，并与DAPI（Beyotime Biotechnology）共定位。使用的次级抗体包括：山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor® 488）（ab150077，Abcam，1:1,000稀释）、山羊抗鼠IgG（H + L）（Alexa Fluor® 555 Conjugate）（4417，CST，1:1000稀释）和山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor® 488）（ab150113，Abcam，1:1,000稀释）。结果通过高含量分析和荧光显微镜进行评估。

2.8. 药物毒性和细胞活力测定

如前所述（Sun 等，2024 年），使用 Cell Titor Glo 检测细胞活力，并测定细胞存活率和细胞存活率（%）。在 96 孔板中，以 1 ×10-4细胞/孔的密度将细胞接种到 96 孔板中；次日丢弃上清液，并与对乙酰氨基酚（4 毫摩尔）一起培养。使用同样的方法测定球体的存活率。该检测使用光度计进行。

2.9. 阿司匹林在共培养芯片中的模拟口服过程

加载了 7 个 2OC 模型，其中 4 个微流道给药对乙酰氨基酚（APAP），其余回路未给予。为了模拟口服过程以及 APAP 诱导的肝脏毒性后果，在加载 2OC 回路后的第二天，向插入物顶部加入 400 微升 10 毫摩尔的 APAP。在 0、0.5、1、2、4、8、24、32 和 48 小时分别收集 10 微升上清液用于液相色谱定量分析。在给药 48 小时后，收集上清液用于各种生物标志物的测量以评估透皮电阻（TEER）。同时收集肝脏球体用于肝脏毒性评估。我们还至少收集了 3 - 5 个用于细胞活力测定，其余部分转移到 96 孔板中保存以用于荧光染色。

2.10. 共培养芯片的肝脏毒性评估

根据推荐的试剂盒方案，测量细胞活力以及白蛋白（ALB）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平，以评估药物给药 48 小时后的肝脏损伤情况。使用线粒体膜电位检测试剂盒（Beyotime Biotechnology，C2001S）进行测定线粒体膜电位。将 2OC 芯片的 3D 包埋肝脏模型转移到 96 孔板中。分别在 Ex/Em = 550/575 和 350/461 纳米检测四甲基罗丹明乙酯（TMRE）和 Hoechst 33342 的荧光信号。使用 CellROX 氧化应激试剂（赛默飞世尔科技，C10444）测定氧化应激。 将 2OC 芯片的 3D 嵌入式肝脏模型转移到 96 孔板中。分别在 485/520 纳米和 350/461 纳米检测 CellROX 和 Hoechst 33342 的荧光信号。使用免疫荧光染色法检测原位 Ki-67、裂解的 caspase-3 和 p53 信号，以评估细胞增殖能力和细胞凋亡情况。

2.11. 样本定量

基于之前的方法（Marin 等，2019 年），使用高效液相色谱法（HPLC）（岛津，LC-2040C 3D）测量对乙酰氨基酚（APAP）的浓度。基底侧腔室（肝脏腔室）用新鲜培养基填充，而顶侧腔室暴露在对乙酰氨基酚培养基中。在每个时间点，如第 2.9 节所述，从两侧各取 10 微升样本。选择甲醇作为蛋白质沉淀剂，在加入 30 微升甲醇以沉淀蛋白质后，通过离心机（13000 转/分钟，4℃，15 分钟）去除沉淀物。使用惰性可持续 C18（150 毫米长度，内径 4.6 毫米，粒径 5 微米，岛津）色谱柱。使用两种流动相：溶剂 A（甲醇）和溶剂 B（蒸馏水），流速为 0.8 毫升/分钟。溶剂组成在 0 - 4 分钟为 5% A，4.01 - 10 分钟为 5 - 100% A，10.01 - 15 分钟为 5% A。进样量为 10 微升，检测使用光电二极管阵列（PDA）检测器（波长 280 纳米）。使用标准曲线测定对乙酰氨基酚的浓度。 药代动力学参数使用非房室模型（NCA）在 Phoenix WinNonlin（Certara，美国）中进行拟合。采用线性梯形线性插值法作为计算方法，模型类型定义为血浆，剂量选项定义为血管外。通过高效液相色谱法测定的肝脏隔室中的对乙酰氨基酚（APAP）浓度 - 时间数据进行拟合，以确定 0 至 48 小时下的曲线下面积（AUC）。峰值浓度（Cmax）和达峰时间（Tmax）直接从个体浓度与时间曲线中读取（高等，2022 年；王等，2022 年）。 采用超高效液相色谱 - 串联质谱法（UPLC-MS）检测 NAPQI 的信号（张等，2018 年）。通过将 N-乙酰基对苯二酚亚胺（NAPQI）（MCE，HY-66005）溶解在甲醇中制备浓度为 1 毫克/毫升的储备溶液，并用甲醇进一步稀释至 1 微克/毫升的工作溶液。对 NAPQI 的形成进行了分析。 在服用对乙酰氨基酚（APAP）后 0.5、1、2、4、8、24、32 和 48 小时，使用配备 AB SCIEX LC AC 系统、PDA 检测器和三重四极杆 6600+仪器的超高效液相色谱 - 质谱法（UPLC-MS）进行检测。通过使用沃特斯 ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（2.1 毫米×50 毫米）实现了色谱分离。 1.7 微米）。使用的洗脱液为（A）0.1%（体积比）的甲酸水溶液和（B）甲醇，采用梯度洗脱程序进行分离，如表S1所示。超高效液相色谱流速为0.3 mL/min，超高效液相色谱-质谱分析使用10 微升样品。对应于解聚电位、碰撞能量、碰撞能量分布和温度的离子对特征为m/z 149.98-108.04（30、30、15和350），对应于NAPQI。

2.12. 统计分析

连续变量以均值±偏差（标准差）表示。采用双尾学生 t 检验来研究两个独立样本之间的差异。数据分析使用 IBM SPSS Statistics 25 版（IBM 公司）进行。线性回归模型使用 SPSS 和 GraphPad Prism 7.00（GraphPad 软件）进行。统计学意义设定为 P≤0.05。

 

3. 结果

3.1. 类器官的培养

将细胞混合物以 1 ×10-6、5 ×10-5 和 2.5 ×10-5 个细胞/孔的密度接种到 Transwell 培养板中，以获得体外肠模型。所有组的跨上皮电阻（TEER）在 21 天内均达到 300 Ω cm2，其中高密度共培养组在 12 天内达到 300 Ω cm2（图 1A）。在第 14 天，高密度共培养组模型中荧光素钠和荧光素葡聚糖均符合渗透性测试要求（图 1B）。当跨上皮电阻达到 200 - 1000 Ω cm2 时，Caco - 2 单层可被视为完整（Iftikhar 等，2020 年）。在后续实验中，选择高密度共培养组来形成肠屏障。 紧密连接蛋白 Occludin 和 ZO-1 经过染色，以显示其在肠等值物培养条件下的完整性。在第 7 天和第 21 天，我们观察到 Occludin 的连续网络结构（图 1C），而在第 14 天和第 21 天的切片中，Occludin 和 ZO-1 呈网状结构（图 1D，图 S1A），表明在第 14 天肠屏障被视为完整的。在第 14 天和第 21    天，转运蛋白 MRP2 和 PGP 分布在肠切片的一侧（图 1E，图 S1B），表明肠模型的极性。总体而言，结果表明在第 14 天获得的肠等值物具有紧密连接和极性；因此，在第 14 天肠屏障被视为成熟的，并用于进一步的实验。 在图 2A 中，模型的直径在 10 天内迅速增大，并稳定在约 400 微米。HE 染色显示在第 7 天（图 2B）没有明显的坏死核心，但在第 10 天（图 2B）有轻度坏死核心或几个细胞凋亡，在第 14 天（图 S1I）有严重的中心坏死区域。与活/死细胞染色（图 2C）所示的死细胞分布一致，在第 10 天检测到更多的死细胞。模型中 ATP 的总量持续增加（图 S1C），而乳酸脱氢酶（LDH）的分泌没有显著增加（图 S1D）。模型稳定生长，随着培养时间的延长，坏死细胞数量增加，通过检测上清液中的 LDH 水平无法检测到内部坏死细胞。为避免坏死细胞核的形成，这些结果表明培养时间限制为 7 天。 在第 7 天（图 2D）和第 10 天，分别通过 CD31、CD68 和α-SMA 信号来追踪人脐静脉内皮细胞 T1（HUVEC-T1）、人肺泡巨噬细胞 THP-1 和人肝脏星状细胞 HHSC 的荧光信号，采用免疫荧光染色法进行追踪。

 

 

图 S1G 表明，上述三种细胞类型在第 10 天仍存在于球体中。在第 7 天检测了转运蛋白 MRP2、PGP 和 BSEP（图 2E），并通过荧光探针 CLF 追踪了胆汁酸外排的功能（图 S1H）。CLF 是 MRP2 和 BSEP 的底物（Boaglio 等，2010 年），CLF 信号也表明了这些转运蛋白在类器官中的功能。   最后，PAS 染色显示有糖原沉积（图 2B），ALB 和 UREA 的增加趋势表明，即使在细胞死亡紧急情况下，肝脏的总合成代谢功能也未受阻碍（图 S1E - F）。这些结果表明，在 14 天内，类器官对肝脏功能的影响相对稳定。  

 

 

3.2. 肠-肝脏芯片的建立及功能概况

在肠模型建立的第十四天，将肠和 50 个肝脏类器官分别装入单独的隔间，以形成肠-肝脏-芯片模型。相互连接的隔间使得液体能够在通道和腔室中循环，促进了两种类器官的共培养。 2OC 系统维持了7天。图3总结了建立2OC模型后体外细胞活力以及肠和肝脏功   能。我们监测了TEER水平（图3A）以评估肠屏障的维持情况，尽管有波动，但TEER始终保持在300以上，表明即使与肝脏等量物共培养，肠屏障的完整性也得到了持续保持。在培养期间，测量了肝脏腔室中肝脏功能指标ALB（图3B）和UREA（图3C）的水平。ALB水平在前3天增加，然后下降，而UREA水平没有显著变化。此外，还评估了LDH、AST和ALT水平以确定肠和/或肝脏类器官的细胞活力（图 3E 和 F）。两个腔室的乳酸脱氢酶（LDH）水平略有升高，而随着培养时间的延长，天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平升高。这些结果表明 2OC 系统内的功能和细胞活力发生了变化，表明尽管维持了肠类器官的完整性，但总体肝脏器官功能和细胞活力意外下降。 接下来，对从 2OC 芯片和 U 底 96 孔板获得的肝脏类器官进行免疫染色信号的比较（图 3G）。首先，在 U 底板培养时，主要观察到 Ki67 信号沿球体边缘分布，并且在球体内部均匀分布，尽管在 2OC 芯片共培养 7 天后，其强度较弱。在 U 底板上培养时，沿肝脏球体边缘的 PGP、MRP2 和 BSEP 信号更强，并且在球体内部也能检测到。在 2OC 芯片共培养 7 天后，观察到沿边缘有强烈的转运蛋白信号，PGP 和 MRP2 的信号强度略强于在 U 底板培养的信号。最后，从两种培养方法来看，细胞色素 P450（CYP）3A4 信号在球体中呈分散状态，2OC 模型的信号略有增强。这些结果描述了肝脏类器官的基本功能，并表明在 2OC 芯片中的肝脏球体中 Ki67、PGP 和 MRP2 的表达与在 U 底板中的有所不同。

 

 

3.3. 在 2OC 二联器官芯片中对过量对乙酰氨基酚的毒性评估

在对 2OC 芯片进行测试之前，将 HepG2 和 Caco-2 细胞暴露于不同浓度的对乙酰氨基酚（APAP）48 小时。当浓度超过 16 毫摩尔时，观察到 Caco-2 细胞的存活率急剧下降（图 S2A），而当 APAP 浓度   超过 2 毫摩尔时，HepG2 细胞的抑制率超过 20%（图 S2A）。这些结果表明，在 2 - 16 毫摩尔的 APAP 范围内可能会产生强烈的肝脏毒性，但在 Caco-2 细胞中未检测到明显的毒性作用。在肝脏类器官中，当浓度超过 2.5 毫摩尔时，细胞存活率降至 80%以下（图 S2B），用 4 毫摩尔的 APAP 处理 48 小时后，测得肝脏类器官的存活率为 70.69 ± 26.97%，与在 HepG2 细胞中观察到的明显毒性趋势一致。 基于这些结果，选择该剂量进行肠类器官的进一步测试。为了达到最终浓度为4 mM，从顶侧施用10 mM的APAP，持续48小时，并测量存活率和TEER，以评估肠细胞的活力和屏障功能。与对照组相比，药物施用后细胞活力没有显著下降（图S2C）。尽管TEER显示出下降趋势（图S2D），但仍保持在300 Ω cm2以上，符合肠屏障完整性的要求。这些结果表明，APAP对肝脏细胞具有明显的细胞毒性，但在所检测的浓度下不会损害肠的屏障功能。 在 2OC 芯片中，含有成熟肠类器官的顶部分室在浓度为 10 毫摩尔的阿司匹林（APAP）的条件下进行了添加。48 小时后，基底侧室显示每个球体有 83.94%的存活率，略高于 U 底板的存活率（70.69%）。尽管在跨上皮电阻（TEER）方面未发现显著差异（图 4A）。 在这两组之间，AST（图 3B）（P < 0.05）和 ALT（图 3C）水平与对照组相比呈上升趋势，而治疗 48 小时后 ALB 水平下降（图 3D）。AST、ALT 和 ALB 反映了肝脏损伤，而 TEER 水平未反映肠道屏障损伤的严重情况。

 

 

最后，我们检测到了 APAP 处理后荧光信号的变化。检测到 Ki67 信号反映了细胞增殖能力的变化（图 4E）。在对照组中，Ki67 信号主要集中在侧面，并且在球体内部观察到散布信号。与对照组相比，治疗后的 Ki67 信号在侧面变得不显著，信号主要集中在内部，这可能是由于最外层细胞比内部细胞更长时间暴露于对乙酰氨基酚（APAP），增强了对细胞增殖的抑制。接下来，检测了 CellROX 水平，并且在 APAP 组中观察到更强的信号（图 4F）。在肝脏球体中观察到 APAP 诱导的细胞凋亡，并且最初使用 TMRE 来评估线粒体膜电位（图 4G）。在 APAP 组中，侧面的信号强度降低，而对照组中信号分布更均匀，表明在给予 APAP 后，球体内部侧向细胞的线粒体膜电位降低。 在 2OC 芯片上孵育 48 小时后，急性胰腺炎（APAP）组中凋亡蛋白裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（图 4H）和 p53（图 4I）的表达显示裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 信号更强，p53 信号略有增强。这些结果表明，在 2OC 芯片中孵育 48 小时后，可以检测到急性胰腺炎诱导的肝脏球体增殖抑制、氧化应激和细胞凋亡。

3.4. 药物在 2OC 二联器官芯片中的吸收与代谢

图5A、B展示了药物浓度在各腔室随时间的演变。在肠腔室中观察到对乙酰氨基酚浓度迅速下降（图5A），同时在肝脏腔室中检测到的药物浓度相应增加（图5B）。在24小时时，肠和肝脏腔室中分别检测到3.93 ±0.46 mM和3.68 ±0.41 mM的对乙酰氨基酚。尽管吸收过程易于观察，但代谢过程并不容易模拟，这从对乙酰氨基酚浓度的不显著下降可以看出，这可能是由于药物剂量过大所致。即使药物总浓度呈下降趋势（图5C），下降趋势也不仅仅是由于采样或药物代谢。我们通过参考32小时测量的浓度计算了48小时无代谢的对乙酰氨基酚的理论总量。当没有细胞代谢发生时，对乙酰氨基酚的量应该为3.16 ±0.53 mol；然而，实际检测到的量为2.95 ±0.20 mol。这些结果表明，即使药物过量，使用我们的2OC芯片也可以模拟药物的吸收和代谢过程。接下来。我们检测到了有毒代谢产物 NAPQI，在上清液中未检测到该物质。 为了精确描述 2OC 芯片中的药物吸收过程，我们使用 NCA 模型计算了对乙酰氨基酚（APAP）的药物吸收动力学参数。计算得出的 Tmax（达峰时间）、Cmax（峰值浓度）和 AUC（曲线下面积）分别为 24 ±11.31 h、3.98 ±0.59 mM 和 157.73 ±14.88 h mM。然而，由于 APAP 浓度下降极小，很难拟合药物消除动力学参数。

 

4. 讨论

本研究利用体外肠-肝脏多器官芯片平台评估药物吸收，并预测毒代动力学及其毒性作用。我们通过在 2OC 多器官芯片平台上耦合两个独立器官构建了一个肠-肝脏芯片系统，以重现口服对乙酰氨基酚（APAP）的连续药物吸收以及随之而来的急性肝脏损伤。在 2OC 系统中，APAP 的吸收率和毒性作用与已知的体内处理过程一致。这些结果表明，在我们的 2OC 模型中可以模拟吸收过程，并且在存在上游肠器官的情况下，可以检测到毒性作用，这与先前的报告一致。我们的发现为未来将多个器官耦合的多器官芯片模型作为辅助模型用于药物毒性预测提供了支持。 基于人类小肠中肠上皮细胞与杯状细胞的比例，使用 Caco-2 和 HT29-MTX-E12 细胞进行肠构建（Chen 等，2017 年；Tsamandouras 等，2017 年）。基于健康肝脏中细胞成分的比例创建肝脏球体（Weiler-Normann 和 Rehermann，2004 年）。基于先前的研究，我们在两周的共培养中检测了结构和肝脏功能。HUVEC-T1 诱导的 THP-1 和 HHSC 的 CD31（Newman，1997 年）、CD68（Gao 等，2018 年）和α-SMA（Chiabotto 等，2021 年）标志物的信号表明了 10 天共培养后的细胞分布。慢性肝脏功能衰竭（CLF）的积累（Hopwood 等，2006 年）、转运蛋白 MRP2、BSEP 和 PGP（Rendic，2021 年）以及白蛋白（ALB）和尿素（UREA）水平的增加（Baudy 等，2020 年）分别说明了胆汁转运、药物外排功能和合成代谢功能增强。慢性肝脏功能衰竭在 3D 球体的管状结构中积累（Ramaiahgari 等，2014 年），该信号表明在培养 7 天后形成了初步的管状结构。 我们基于我们的肠和肝脏类器官构建了一个基于微流控装置的肠-肝脏芯片（Marin 等，2019 年；Maschmeyer 等，2015 年）。其他肠-肝脏模型表明，器官表面积和代谢能力会影响口服药物的吸收和代谢（Lee 等，2017 年）。使用天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）（Meunier 和 Larrey，2019 年）来评估肝脏毒性。3 天共培养后，其增加趋势表明存在潜在的肝脏细胞损伤，而白蛋白（ALB）的减少趋势可能是由于营养供应不足、药物给药、营养不良、蛋白质摄入量减少以及肝脏损伤（Belinskaia 等，2020 年；Meunier 和 Larrey，2019 年）。 在本研究中，CYP3A4 信号略有增强，这与之前的研究结果一致，表明 CYP3A4 的活性在肠-肝脏共培养后得到增强（Chen 等，2018 年 b；Shinohara 等，2021 年）。

由于以往的研究主要关注肠-肝脏共培养后肝脏类器官代谢活动的增强（Shinohara 等，2021 年），我们重点关注转运蛋白 MRP2、PGP 和 BSEP，它们介导外源性物质从肝脏细胞的清除（Jetter 和 Kullak-Ublick，2020 年）。我们的结果清楚地表明，2OC 模型能够模拟口服后有毒危害的吸收，并且上清液易于保存，以便用于人类生物标志物的监测。

选择该浓度的原因如下：1）在测试浓度下，肠屏障的完整性不会受损；2）该药物对肝脏的毒性作用高于对肠的毒性作用。尽管对乙酰氨基酚（APAP）的吸收在很大程度上受胃排空的影响（Toes 等，2005 年），但它主要通过近端小肠的被动扩散被吸收（M´esza´ros等，2022 年）。在体外，高浓度的 APAP 已被证明会降低肝脏细胞活力（Bell 等，2020 年）。低剂量下，APAP 显示出有限的毒性作用；然而，过量或滥用药物时，APAP 会导致急性严重的肝脏细胞损伤（Bunchorntavakul 和 Reddy，2018 年）。随着时间的推移，暴露浓度与毒性作用之间的关系可以解释时间依赖性毒性的风险以及化学品的分子机制（Tennekes 和 Sánchez-Bayo，2013 年）。APAP 的浓度对于反映药物暴露情况至关重要；因此，我们检测了 APAP 的转运情况（Bessems 和 Vermeulen，2001 年；Krenkel 等，2014 年；Makin 和 Williams，1996 年）。

对乙酰氨基酚（APAP）具有良好的口服生物利用度（88%），因为它能被良好吸收，在摄入后90分钟内达到血浆浓度峰值（Hodgman和Garrard，2012）。在我们的研究中，我们的2OC模型（24 ±11.31 h）中的Tmax预测值高于临床数据（0.33-4 h）和其他2OC芯片的结果（6 h）（Marin等，2019）。APAP在治疗剂量下吸收迅速，随着剂量的增加而减缓（Rosenberg等，1981）。在治疗剂量下，APAP的血浆半衰期在1.5到2.5小时之间；然而，我们检测到24小时后两个腔室的药物浓度平衡，与之前的研究结果一致。Rawlins等（1977）测量了志愿者口服APAP（500、1000和2000毫克）后的血浆浓度，结果表明2000毫克时Tmax延迟。一些病例报告显示，过量服用APAP制剂会导致血浆浓度峰值延迟和APAP吸收延长（Chiew等，2010；Graudins等，2010；Roberts和Buckley，2008）。Mazaleuskaya等（2015）总结说，由于APAP过量后代谢受损，半衰期延长至4-8小时。选择了一种无肠毒性的肝脏毒性剂量，其给药浓度（对乙酰氨基酚，4 毫摩尔，604.64 毫克/升）约为中毒血浆浓度（100 - 150 毫克/升）的四到六倍，以及昏迷致命血浆浓度（200 - 300 毫克/升）的二到三倍（Schulz 等，2020 年）。由于体外对乙酰氨基酚的毒性浓度（Bell 等，2020 年）远远超过人体的治疗血浆浓度（5 - 25 毫克/升）（Schulz 等，2020 年），在我们的研究中，48 小时内未观察到明显的药物消除过程。药代动力学（PK）的辅助证据表明，芯片模型需要进一步修改，特别是要进一步研究体外和临床数据向临床的转换方法，以提高体外结果与临床的相关性。

最后，我们检测了我们的设备对肝脏球体细胞的毒性作用。与 96 孔板相比，2OC 芯片中球体细胞的存活率略有提高，具体反映了药物毒性随药物浓度和时间暴露的变化。过量摄入对乙酰氨基酚（APAP）会显著增加血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平（Acheampong 和 Thomas，2016；Stockman，2008）；然而，在 2OC 模型中暴露 48 小时后，AST 和 ALT 水平略有增加。同时，ALB 的下调表明肝脏的代谢功能受到抑制，并且发生了严重的肝脏损伤。这种下降与之前的一份报告（Wu 等，2022 年）一致。药物递送后，最外层细胞的Ki67（细胞分裂所必需的） 信号减弱，表明最外层细胞的增殖受到抑制。最初，我们在急性胰腺炎治疗后检测到受阻的肝脏球体。

在治疗剂量下，对乙酰氨基酚主要通过葡萄糖醛酸化和硫酸化转化为无毒代谢产物。对乙酰氨基酚被 CYP2E1 酶氧化并激活为有毒产物 N-乙酰天冬氨酸氨基转移酶抑制剂（NAPQI）。NAPQI 耗尽谷胱甘肽（GSH）并将其转化为对乙酰氨基酚半胱氨酸。当 GSH 低于正常水平的 30%时，NAPQI 不再被还原，引发毒性反应。尽管在动物血清和器官中可检测到 NAPQI（Russomanno 等，2023 年；Zhang 等，2018 年），但除了在原代肝脏细胞中（Pingili 等，2019 年），在细胞系中检测到这种不稳定的中间产物仍然困难（Zhang 等，2020 年）。如前所述（Zhang 等，2020 年），只有少量的对乙酰氨基酚转化为 NAPQI，其半衰期极短（Coles 等，1988 年；Madsen 等，2007 年）。它可以在 130 毫秒内迅速且轻易地通过与 GSH 结合而被解毒（Coles 等，1988 年；Madsen 等，2007 年），或者通过 NADPH、二氢烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和还原酶还原回对乙酰氨基酚（Zhang 等，2020 年），因此在其体外模型中检测 NAPQI 存在困难（Zhang 等，2020 年）。在谷胱甘肽（GSH）耗竭之后会发生 APAP 蛋白结合，这是肝脏毒性机制中的一个早期事件（Jaeschke 等，2014 年；McGill 等，2013 年）。作为一种替代的体外模型，GSH 耗竭（Leclerc 等，2015 年）、氧化能力（Geib 等，2021 年；Leclerc 等，2015 年）、共价蛋白结合（Geib 等，2019 年、2021 年；Pierce 等，2002 年）以及使用系统生物学模型获取的体外毒性信息（Leclerc 等，2015 年），可能是追踪或提示 NAPQI 形成和积累的替代方法。NAPQI 与线粒体蛋白结合以诱导蛋白质酰化，这会导致肝脏细胞坏死或氧化应激以及线粒体功能障碍，最终导致细胞凋亡和肝脏损伤（Bessems 和 Vermeulen，2001 年；Krenkel 等，2014 年；Makin 和 Williams，1996 年；Saito 等，2010 年）。在急性胰腺炎（APAP）诱导的肝脏毒性发病过程中，肝脏细胞会出现线粒体功能障碍和氧化应激（Shan 等，2018 年；Ye 等，2018 年）。治疗后，肝脏模型中TMRE信号的降低表明肝脏细胞（尤其是侧细胞）的线粒体膜电位降低，线粒体功能受到影响。线粒体膜电位表示线粒体活性的变化和线粒体稳态的破坏（Vianello等，2023）。在急性肝脏功能衰竭的早期阶段，线粒体膜电位降低，导致线粒体形态变化并影响线粒体功能，这是肝脏细胞损伤的初始信号（Li等，2011；Umbaugh等，2021）。考虑到急性肝脏功能衰竭引起的氧化应激会损害蛋白质折叠并触发内质网应激（Ferret，2001；Ye等，2018），我们使用CellROX来定位活性氧信号，并在急性肝脏功能衰竭组中观察到大量活性氧信号的分布。这些结果表明，使用2OC芯片模拟急性肝脏功能衰竭过量后，可以在肝脏模型中检测到线粒体膜电位和细胞氧化应激的变化。

在急性肝脏功能衰竭的早期阶段会发生肝脏细胞凋亡（Possamai 等，2013 年）。急性肝脏功能衰竭（APAP 诱导）会导致谷胱甘肽（GSH）耗竭，APAP 触发线粒体毒性通路和过程，将半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3/7 前体转化为活性裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Baek 等，2016 年）。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 - 3 是细胞凋亡的关键执行者，其前体酶形式在转化为活性形式之前会被裂解（Fernandes-Alnemri 等，1994 年）。肿瘤抑制基因 p53 通过转录激活来调节细胞凋亡（Arakawa，2005 年）。APAP 诱导的肝脏毒性可能导致 p53 的轻微上调（Chen 等，2018a）。APAP 给药后，裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 - 3 蛋白信号显著增加，p53 信号略有增强，表明 APAP 诱导了细胞凋亡信号。

然而，不可否认的是，动物模型为现代医学的理解和进步做出了重大贡献，尤其是在过去几十年中，对于药物和化学品的安全性评估而言，这可能是替代性体外模型无法完全取代的。尽管这些新模型已经并将继续在生物医学和监管研究中发挥重要作用，允许对一种物质的系列影响进行研究，并提供高灵敏度，不受其他生物现象的干扰（Kaplan 等，2024 年）。另一方面，应当强调的是，2OC 模型肯定还无法取代现有的生物模型，而是作为一种研究工具，提前提供特定的见解，以减少药物筛选所需的动物数量。我们的结果表明，2OC 模型可以使用荧光探针测量药物吸收并检测与多种毒性相关的信号变化，展示了多器官芯片作为辅助证据同时检测药物疗效/毒性和药代动力学潜力的可能性。

 

5. 结论

我们建立了一个肠-肝脏二联器官芯片系统，并通过模拟过量对乙酰氨基酚（APAP）后的急性肝脏损伤过程来评估其毒性作用。通过共培养 Caco-2 和 HT29-MTX-E12 细胞建立了肠类器官，并用 HepG2、HUVEC-T1、PMA 诱导的 THP-1 细胞和 HHSC 建立了肝脏球体类器官。在多器官芯片组中，肝脏类器官中 PGP、MRP2 和 CYP3A4 的表达略有改善。在获得两个腔室中 APAP 的浓度-时间曲线后，使用 NCA 法拟合毒代动力学参数 Tmax、Cmax 和 AUC。APAP 处理增加了肝脏毒性生物标志物 AST 和 ALT 的水平，减少了白蛋白（ALB）的分泌，抑制了细胞增殖，增强了活性氧（ROS）信号，降低了线粒体膜电位，激活了 caspase-3，并增强了 p53 信号。本研究为器官芯片在药物毒性研究中的应用提供了辅助证据，同时检测药物含量和毒性反应，为预测候选化合物的药代动力学和毒理学特性提供了潜力。

 

 

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