应用案例：蛋白稳定性分析用于新型疫苗开发

 

 

蛋白稳定性分析仪PSA-16助力武汉大学病毒学国家重点实验室科研工作者于2024年8月份在Nature子刊《npj Vaccines》杂志上发表论文“An attachment glycoprotein nanoparticle elicits broadlyneutralizing antibodies and protects againstlethal Nipah virus infection”。本研究以尼帕病毒G蛋白头部域为抗原靶标，成功开发出一种新型的、安全有效的自组装蛋白纳米颗粒疫苗，该疫苗能够诱导抑制多种亨尼帕病毒感染的广谱中和抗体，并对尼帕病毒感染的仓鼠提供完全保护。​

Zhou, D. et al. 

npj Vaccines 9, 158 (2024).

https://doi.org/10.1038/s41541-024-00954-5

蛋白质的热稳定性是指蛋白质多肽链在温度影响下的形变能力，主要体现在温度改变时多肽链独特的化学特性和空间构象的变化，变化越小热稳定性越高。蛋白质的热稳定性受到不同温度、pH值、离子强度等外界因素的影响，在生物技术、药物研发以及食品工业等领域，具有重要意义。

蛋白质变性温度是生物学家们研究蛋白质的热稳定性的一个重要的概念，是指蛋白质在特定温度条件下受到热力作用时，其结构发生变化的温度点，一般温度较高时，蛋白质从稳定的三维结构变化成松散的无序结构。蛋白质的热稳定性一般使用热变性中点温度（Tm）来表示，即蛋白质解折叠50% 时的温度。

01 前言

尼帕病毒（NiV）是一种负义单链RNA病毒，最初是在1998年至1999年马来西亚和新加坡爆发期间分离和鉴定的。NiV感染可导致严重的脑炎和呼吸道疾病，病死率高达75%。另外在幸存者中也观察到长期神经系统疾病和NiV感染复发。目前，还没有批准的可用于人类的疫苗或治疗方法。NiV编码一种病毒膜蛋白：糖蛋白（G），G蛋白位于病毒表面，负责受体识别和结合，受体结合后，G蛋白经历一系列构象变化，完成与靶细胞的膜融合，从而帮助病毒进入靶细胞并引发感染。此外，许多中和和保护性抗体主要针对G蛋白，表明G病毒蛋白是疫苗开发的关键抗原。最近已经开发了多种针对NiV感染的疫苗平台，包括亚基疫苗、mRNAs、病毒样颗粒（VLP）、病毒载体疫苗和DNA疫苗，但还没有对自组装纳米粒子平台进行NiV感染评估。

 

02 摘要

作者设计了一种基于铁蛋白的自组装纳米粒子，在表面显示NiV G头部结构域（NiV G-铁蛋白，NiV G-ferritin），并评估了可溶性NiV G头结构域（NiV sG）或NiV G-铁蛋白引发的免疫反应，并且通过一系列研究数据表明NiV G铁蛋白是一种安全有效的尼帕病毒感染候选疫苗。

 

 

03 结果

作者借助北京佰司特科技有限责任公司自主研发的蛋白稳定性分析仪PSA-16，通过差示扫描荧光法（Differential scanning fluorimetry，DSF）原理进行NiV G-ferritin和NiV sG的热稳定性分析，结果表明，NiV G-ferritin和NiV sG表现出相似的热稳定性，Tm为~65°C，表明NiV G和ferritin的融合对其结构稳定性没有显著影响。

 

04 方法

蛋白稳定性分析仪PSA-16（北京佰司特科技有限责任公司）通过差示扫描荧光法（Differential scanning fluorimetry，DSF）测定靶蛋白的热稳定性。将样品稀释至0.5mg/mL，并将20μL稀释后的样品装入石英玻璃管中。

使用23至97°C的线性温度扫描，以1°C/min的加热速度实时动态测量靶蛋白在280nm紫外激发下的330nm和350nm的荧光强度（F）。

根据F350nm/F330nm曲线的斜率计算热变性中点温度（thermal transition midpoint，Tm）。每个样品平行测量四次。

 

Part 01. 实验步骤

1） 在进行热稳定性实验时，首先设置起始温度。起始温度最低为15℃，可通过“+”“-”按钮进行调整。

 

2） 设置完起始温度后，接下来可以设置终点温度。终点温度最高为110℃，可通过“+”“-”按钮进行调整。

3） 设置完起始温度和终点温度后，接下来设置升温速率。升温速率可以在0.1-15℃/min范围内调整。

4） 可以根据样品浓度的不同，选择检测灵敏度。高检测灵敏度适合0.05-1 mg/ml的样品，中检测灵敏度适合1-10 mg/ml的样品，低检测灵敏度适合10 mg/ml以上的样品。

5） 设置好以上参数之后，可以点击选取需要检测的样品，并可以输入样品名。选中的样品会以蓝色方框提示。

 

6） 参数设置完成后，即可点击“预扫描”按钮。仪器会对样品进行扫描，检查荧光值是否符合实验要求。

 

7） 在预扫描通过后，即可点击“开始实验”按钮进行热稳定性测试。

 

 

Part 02. 实验结果

8） 试验完成后，软件会自动进行数据分析并进入结果查看界面。

9）在结果查看界面，会显示每个样品的变性曲线，变性曲线的一阶导数，变性温度Tm值和变性起始温度Ton值。

10）如有软件无法自动识别的一阶导数峰值，还可以通过“添加Marker”按钮手动添加指示。

11）如需导出原始数据或者图片，可通过“导出数据”和“导出图片”按钮实现。

 

 

作者也致谢了北京佰司特科技有限责任公司，提供自主研发的蛋白稳定性分析仪PSA-16，获得蛋白样品热稳定性分析的数据。

 

 

05 内源差示扫描荧光法（inDSF）

内源差式扫描荧光inDSF，基于蛋白质中特定氨基酸的荧光特性。这些氨基酸的荧光强度与其所处的微环境密切相关，因此，当蛋白质的结构发生变化时，这些氨基酸的荧光信号也会随之改变。不需要额外的荧光染料加入到检测体系中，利用蛋白内部芳香族氨基酸的自发光原理。不需要任何额外的标记或固定步骤，避免引入结果的不确定性。

研究发现，蛋白质分子中芳香环氨基酸在处于不同极性的微环境时 (如疏水或亲水环境中)，其被激发的内源荧光的最大发射光谱会发生位移。蛋白质中内源荧光主要来自含芳香环氨基酸如色氨酸 (Trp)，苯丙氨酸 (Phe) 和酪氨酸 (Tyr)，其中以色氨酸内源荧光最强。当它在蛋白内部时，发射光主要在330波段，当蛋白一旦去折叠，暴露在溶剂中，发出的光就会从330波长红移到350。所以通过280激发，检测330/350的比值变化，就能测量蛋白质的Tm值。

以色氨酸为例，在蛋白质疏水的内核微环境中，其内源荧光最大发射波长在330 nm左右，而在亲水的极性微环境中，色氨酸的内源荧光最大发射波长则出现在350 nm左右。蛋白质热变性或者化学变性通常会导致色氨酸残基周围微环境的极性发生变化，使通常被包埋于蛋白质疏水内核的色氨酸逐渐暴露于亲水的环境中，从而导致发射内源荧光最大发射波长发生红移(Red Shift)，即向更大的波长区域 移动。

特点：内源差式扫描荧光DSF无需复杂的样品处理或标记步骤，实验相对简便。但不是所有蛋白质都含有足够的荧光基团，且可能会受其他基团影响。

 

06 蛋白稳定性分析仪PSA-16

北京佰司特科技有限责任公司于2023年推出了自主研发的第一款国产的蛋白稳定性分析仪PSA-16。

PSA-16的性能和参数达到进口设备的水平，价格却远低于进口产品，弥补了目前国产自主设备在蛋白稳定性研究分析领域的空白。

主要参数★ 测定参数：Tm、Cm、ΔG等；

★ 样品通量：16个；

★ 样品体积：≤20 uL；

★ 浓度范围：0.01-200 mg/ml；

★ 温控范围：15-110度；

★ 变温速度：0.1-15度/分钟；

★ Tm重复性：CV小于1%；

★ 耗材参数：一次性，无需清洗；

★ 八联排设计，适配多通道移液器；

 

多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16基于内源差示扫描荧光（ifDSF）技术，广泛应用于蛋白质稳定性研究、蛋白质类大分子药物（抗体）优化工程、蛋白质类疾病靶点的药物小分子筛选和结合力测定等领域，具有快速、准确、高通量等诸多优点。蛋白质中色氨酸/酪氨酸的荧光性质与它们所处的环境息息相关，因此可以通过检测蛋白内部色氨酸/酪氨酸在加热或者添加变性剂过程中的荧光变化，测定蛋白质的化学和热稳定性。

PSA-16采用紫外双波长检测技术，可精准测定蛋白质去折叠过程中色氨酸和酪氨酸荧光的变化，获得蛋白的Tm值和Cm值等数据；测定时无需额外添加染料，不受缓冲液条件的限制且测试的蛋白质样品浓度范围非常广（10 µg/ml - 250 mg/ml），因此可广泛用于去垢剂环境中的膜蛋白和高浓度抗体制剂的稳定性研究。此外，PSA-16具有非常高的数据采集速度，从而可提供超高分辨率的数据。同时PSA-16一次最多可同时测定16个样品，通量高；每个样品仅需要15 uL，样品用量少，非常适合进行高通量筛选。PSA-16操作简单，使用后无需清洗，几乎无维护成本。

 

多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16应用涵盖植物、生物学、动物科学、动物医学、微生物学、工业发酵、环境科学、农业基础、蛋白质工程等多学科领域。蛋白质是最终决定功能的生物分子，其参与和影响着整个生命活动过程。现代分子生物学、环境科学、动医动科、农业基础等多种学科研究的很多方向都涉及蛋白质功能研究，以及其下游的各种生物物理、生物化学方法分析，提供稳定的蛋白质样品是所有蛋白质研究的先决条件。因此多功能蛋白质稳定性分析系统在各学科的研究中都有基础性意义。

1.    抗体或疫苗制剂、酶制剂的高通量筛选

2.    抗体或疫苗、酶制剂的化学稳定性、长期稳定性评估、等温稳定性研究等

3.    生物仿制药相似性研究（Biosimilar Evaluation）

4.    抗体偶联药物（ADC）研究

5.    多结构域去折叠特性研究

6.    物理和化学条件强制降解研究

7.    蛋白质变复性研究（复性能力、复性动力学等）

8.    膜蛋白去垢剂筛选，膜蛋白结合配体筛选（Thermal Shift Assay）

9.    基于靶标的高通量小分子药物筛选（Thermal Shift Assay）

10.    蛋白纯化条件快速优化等

 

 

北京佰司特科技有限责任公司 (https://www.best-sciences.com)

类器官串联芯片培养仪-HUMIMIC；灌流式细胞组织类器官代谢分析仪-IMOLA；光片显微镜-LSM-200；

蛋白稳定性分析仪-PSA-16；单分子质量光度计-TwoMP；超高速视频级原子力显微镜-HS-AFM；

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