前沿进展：干涉散射显微术iSCAT显微技术用于单分子分析

iSCAT 显微镜

iSCAT 显微镜照亮样品，样品会散射并反射照明光。这种散射光返回显微镜，在界面处干扰参考光场。散射光场与已知参考光场的干涉允许对纳米级样品进行灵敏的 iSCAT 检测。图 2概述了这一概念，其中将明场显微镜中的光路与 iSCAT 进行了比较。

图 2：明场与 iSCAT 中的光路。在明场中，照明光被散射并与 透射光发生干涉，这意味着明场图像是干涉阴影。在 iSCAT 中，散射光 (Es) 在分束器处与参考光 (Er) 发生干涉。改编自 Taylor 和 Sandoghdar (2018)。

通过获得一些光学器件、光源和灵敏的科学相机，可以轻松实现这种成像设置。反射光（背景）不会被拒绝，并且信号与散射幅度和样品体积呈线性比例。 iSCAT显微镜的例子如图3所示。

图 3： iSCAT 显微镜设置。照明光聚焦在显微镜的后焦平面上。插图放大显示了光与样品的相互作用，显示了反射和散射的光波。该散射/反射光通过物镜返回并与参考光场结合。散射光形成聚焦光束，而反射光形成平行光束。图片改编自 Piliarik 和 Sandighdar (2014)。

iSCAT的应用

iSCAT 显微镜已成功用于检测单个未标记的蛋白质，但在对这种大小的样品进行成像时要记住的一个重要考虑因素是信号水平的指数下降。虽然 5 nm 纳米颗粒仅比 50 nm 纳米颗粒小 10 倍，但接收到的信号却小 1,000,000 倍！由于 iSCAT 测量中信号非常低且存在噪声，例如激光强度噪声（由于功率波动和光束不稳定性）和探测器噪声（读取噪声、暗电流、光子散粒噪声）。需要低噪声和高灵敏度的探测器。图5演示了 iSCAT 在检测单个未标记颗粒（例如蛋白质和病毒）时的用途。

图 5：使用 iSCAT 显微镜拍摄的纳米级样品图像。 A) 肌动蛋白丝上的单一蛋白质追踪（规模：5 µm）。 B) 使用荧光（左）和 iSCAT（右）（比例：1 µm）成像的量子点。nC) SV40病毒（45 nm in） 的 iSCAT 成像（左，比例：1 µm）和追踪（右，比例：100 nm） 直径）。 D) 使用共焦扫描传输 iSCAT 成像的甲苯二异氰酸酯 (TDI) 分子。在不同波长下成像 ，即 633 nm（左，绿色）和 671 nm（中，红色），右侧显示背景去除（绿-红）。图片改编 自 Taylor 和 Sandoghdar (2018)。

iSCAT 还具有背景去除功能，以便从大量蛋白质或颗粒中挑选出单个蛋白质或颗粒。 iSCAT 对光路中最细微的变化（低至小蛋白质水平）都极其敏感。通常，使用 iSCAT 显微镜成像的样本是动态的，这意味着可以在时间尺度上去除背景，类似于其他使用闪烁荧光团来定位信号的超分辨率技术。为了用 iSCAT 定位粒子而进行的背景扣除如图 4所示。

图 4： iSCAT 中的背景去除。左图显示直径为 10 nm 的金纳米粒子（黑色）和由基底粗糙度引起的背景。两张图像（t1 和 t2）显示了不同时间的纳米颗粒，显示蓝色颗粒的出现。为了分离蓝色粒子，将两个图像相减（t2-t1），去除背景。图片改编自 Taylor 和 Sandoghdar (2018)。

iSCAT 和 TIRF

iSCAT 的优势之一是它与其他荧光成像方法（例如落射荧光和全内反射荧光 (TIRF)显微镜）的兼容性。这可以通过在系统的光路中添加单个二向色镜来轻松完成，其中将 iSCAT 波长与荧光激发和发射分开。通过这样做，单个光学器件可以将实验装置分为 iSCAT 和 TIRF 显微镜，它们可以单独使用或相互组合使用。同时 iSCAT 和 TIRF 的示例如图 6所示其中单个肌球蛋白 5a 分子分别被 20nm 金纳米颗粒和量子点标记。在这里，通过利用蓝色荧光激发和红色 iSCAT 照明，组合使用了 TIRF 和 iSCAT 显微镜。这使得能够使用常见荧光团（包括 Alexa 488、GFP 和量子点）进行成像，而不会受到 iSCAT 通道的干扰。

图 6：使用 iSCAT 和 TIRF 进行单粒子跟踪同步成像。 A) 肌球蛋白 5a 的示意图，该肌球蛋白 5a 被 20 nm 金颗粒（红色）和量子点（蓝色）双重标记，每个都附着在头域上。 B) 为同步 iSCAT 和 TIRF 测量而获取的平坦校正 (i)、背景校正 (ii) 和相应的荧光图像 (iii)。比例尺为1um。图片改编自 Arroyo 等人。 （2016）。

使用 iSCAT 追踪分子

除了检测足够数量的光子之外，单粒子跟踪中最重要的因素之一是估计和去除光学设置和样品内散射的背景的能力。例如，使用 iSCAT 可以在神经元细胞轴突的薄区域上以非常小的定位精度跟踪 40 nm GNP 标记的膜蛋白。此外，利用iSCAT的干涉性质，可以观察管状轴突结构上分子的3D运动，如图7所示。

图 7：使用 iSCAT 对细胞进行单粒子追踪。 （a）金纳米粒子（GNP）在神经元细胞轴突上追踪的示意图。 (b) 神经元细胞上 GNP 标记的膜蛋白的 iSCAT 图像。 (c) 原始 iSCAT 图像的背景扣除； (e) 沿神经元细胞轴突移动的分子进行三维重建的示意图。黄色箭头表示国民生产总值。规模：2 µm。图片改编自 Young 和 Kukura (2019)。

iSCAT 相机

iSCAT 是一种以高分辨率对纳米级物体进行成像的强大方法，可与包括 TIRF 在内的其他显微方法结合使用。这可以通过使用一些光学器件和灵敏的相机来实现。对于 iSCAT 应用，可提供高信噪比的高帧率和高灵敏度相机可以极大地提高该方法的效率。因此，背照式 sCMOS相机将有助于以非常短的曝光时间和高采集速度进行成像。极低的噪音性能在这里也很重要。

概括

iSCAT 可成功、灵敏且无标记地检测纳米级样品。 iSCAT 的定位具有出色的空间和时间分辨率，这得益于高信噪比 (SNR)。通过使用样品散射的光，iSCAT 绕过了对荧光的需求，而是利用优雅的物理原理生成了一种强大的技术，可以在超分辨率水平上看到令人难以置信的小样品。

干涉散射显微术(Interferometric Scattering Microscopy)

干涉散射显微术(Interferometric Scattering Microscopy)，简称iSCAT显微术，是一种基于光散射的成像模态，用于跟踪纳米尺度的标记物，并实现低至单分子水平的无标记光学探测。与荧光显微镜相比，iSCAT不受染料光化学和光物理学的限制，也没有荧光标记的要求。

图8：在过去的几十年中，出现了两种主要的基于散射的显微镜技术路径：纯散射和基于干涉。为了说明两种方法的区别，我们将其与传统的落射式荧光显微镜进行了比较。

落射式荧光显微镜

如图1a所示，当激光经过二向色镜DM和分光镜BS后进入物镜中，并汇聚在样品上实现照明。样品中的荧光分子受到激发后发出荧光，部分荧光被下物镜收集，然后被CCD相机采集，这就是传统的落射式荧光显微镜的成像原理。但这样做有一个缺点，照明的激光也会在玻片上发生反射，和样品荧光一起被CCD探测器收集，导致成像背景很高，不适合检测纳米级别的样品。

荧光显微镜的另一个缺点是需要对样品进行标记，然而大多数分子的荧光亮度和光稳定性都不够好。此外，荧光标记可能会扰乱所研究的生物微环境的内在特性和潜在动力学，在这种情况下，采用无需标记(label-free)的成像手段或许是更好的选择。

纯散射

其中一种方法是利用散射光，任何物体只要其折射率与周围介质不同，就会散射光，因此能够进行无标记的成像和传感。在极端情况下，即使是缓冲液中的单个蛋白质也会充分散射，从而无需任何标记即可实现单分子传感和成像。

如图1a所示，我们在垂直于样品面的某一位置放置探测器，这样样品荧光和激发光都不会被探测到，只有被样品散射的激发光会触及探测器形成散射信号，我们将其称为纯散射(pure scattering)成像。但在实际的实验过程中，我们通常会选择采用图1b中的方式来获取纯散射信号。

利用全反射获取纯散射信号：如图1b所示，当入射光与玻片的夹角超过全反射的临界角时，几乎所有入射光都被反射，只有全反射产生的倏逝波会与样品相互作用，产生散射信号。

基于干涉

如图1c所示，最后探测器探测到的光信号除了散射信号，还有透射光信号，由于是由同一光源产生，在探测器表面会发生相干，因此称为干涉散射。当然与散射信号发生相干并不一定是透射光信号，也可以额外引入一束相干的参考光。

应用

iSCAT显微镜已成功用于检测单个未标记的蛋白质，由于 iSCAT 测量中的信号非常低且存在噪声，例如：

激光强度噪声：由于功率波动和光束不稳定

探测器噪声：读取噪声、暗电流、光子散粒噪声

这使得对 ~5 nm 粒子的灵敏检测极具挑战性，需要具有低噪声水平和高灵敏度的探测器。

图9：SV40病毒（直径45 nm）的iSCAT成像（左，比例尺：1µm）和基于iSCAT的单分子追踪（右，比例尺：100 nm）