应用案例（超高速视频级原子力显微镜-HS-AFM）：“眼见为实”超高速视频级原子力显微镜实时成像研究膜蛋白的形成过程和转运机制

翻译整理：北京佰司特科技有限责任公司     

超高速视频级原子力显微镜（High-Speed Atomic Force Microscope，HS-AFM）由日本 Kanazawa 大学 Prof. Ando 教授团队研发，日本RIBM公司（生体分子计测研究所株式会社，Research Institute of Biomolecule Metrology Co., Ltd）商业化的产品，可以达到视频级成像的商业化原子力显微镜。HS-AFM突破了传统原子力显微镜“扫描成像速慢”的限制，能够在液体环境下超快速动态成像，分辨率为纳米水平。样品无需特殊固定，不影响生物分子的活性，尤其适用于生物大分子互作动态观测。超高速视频级原子力显微镜HS-AFM主要有两种型号，SS-NEX样品扫描（Sample-Scanning HS-AFM）以及PS-NEX探针扫描（Probe-Scanning HS-AFM）。推出至今，全球已有100多位用户，发表 SCI 文章 300 余篇，包括Science, Nature, Cell 等顶级杂志。

相较于目前市场上的原子力显微镜成像设备，HS-AFM突破了 “扫描成像速慢”的限制，扫描速度高可达 20 frame/s，并且有 4 种扫描台可供选择。样品无需特殊固定染色，不影响生物分子的活性，尤其适用于生物大分子互作动态观测。液体环境下直接检测，超快速动态成像，分辨率为纳米水平。探针小，适用于生物样品；悬臂探针共振频率高，弹簧系数小，避免了对生物样品等的损伤。悬臂探针可自动漂移校准，适用于长时间观测。采用动态PID控制，高速扫描时仍可获得清晰的图像。XY轴分辨率2nm；Z轴分辨率0.5nm。

HS-AFM不仅拥有超高扫描速率与原子级别分辨率，而且具有操作的简易性，使得对单分子动态过程的捕捉变得十分方便，为科研工作者研所和理解生物物理、生物化学、分子生物学、病毒学以及生物医学等领域的单分子动态过程提供了一款强大的工具。

全新的HS-AFM采用了新的高频微悬臂架构，更低噪音、更高稳定性的2控制器，高速扫描器，缓冲防震设计，主动阻尼，动态PID，驱动算法优化，多种前沿技术，可以实现在超高速下获取高分辨的生物样品信息。新系统整合了基于工作流程的操作软件，直观的用户界面与流程化、自动化的设置使得研究人员可以专注于实验设计，不需要复杂的操作和条件设置，快速获取数据，加速研究的产出。

1）膜蛋白的结构形成过程研究

成孔毒素（Pore-forming toxin, PFT）能在靶细胞膜上寡聚化形成穿膜通道, 破坏细胞膜结构并使其渗透性增强而导致细胞渗透性溶解。 PFT寡聚体在细胞膜上可以连接形成密排六方结构（hcp）。

Lysenin是来源于蚯蚓的一种PFT，可在鞘磷脂/胆固醇（SM/chol）双层膜结构中寡聚化并形成hcp。实验中，研究人员使用了日本RIBM的超高速视频原子力显微镜（HS-AFM），对SM/chol双层膜结构中lysenin寡聚体组装成hcp的动态过程进行了实时成像，发现了hcp结构形成的规律。

研究人员将lysenin与SM/chol双层膜结构在云母为基底的环境下共同培养后使用HS-AFM进行成像。下图显示了lysenin寡聚体形成的hcp在膜结构上的分布。白色六边形表示一个hcp单元，箭头表示未完全形成的寡聚体。通过计算可以获得Hcp单元的间距和寡聚体直径等数据，与之前使用电镜的研究获得的数据一致。

通过HS-AFM还可以获得lysenin寡聚体的三维图像。对各个寡聚体的高度数据进行统计，可以发现高度分布主要为两种，高度较低的寡聚体已经嵌入了膜结构中，并可能形成了核孔。

接下来研究人员对400×300nm区域内的SM/chol双层膜结构上的lysenin组装过程进行了动态成像。图A展示了lysenin簇的形成并可以检测簇的增长方向（图B），终组装形成hcp结构。 

在黑色的云母基底上也能观察到lysenin，分析双层膜结构上和基底上的lysenin半径大小可以得出，双层膜结构上的lysenin形成了寡聚体进而组成hcp结构，而基底上的lysenin处于单体或不规则聚集形态，无法形成寡聚体，这也与之前的研究结果一致。

对视野内的lysenin簇如B图进行划分并进一步分析可以得出：

1. Lysenin形成单个簇后，在双层膜上水平扩散，聚集排列形成hcp结构；

2. 新形成的簇会组成新的矩形排列（彩色矩形）或填充到已有的矩形排列的空缺处，有些已经形成的簇会在膜上扩散或分解；

3. 矩形排列的方向可变（如上方红色矩形）；

4. 绝大多数Lysenin簇在装配开始就会聚集形成簇，而不是随机分布在膜上。

 

HS-AFM还可以在更高的放大倍数下以更高速率成像，以实现对lysenin簇组装成hcp结构的动态进行更详细的检测。

通过对结果的分析可以得出，大部分从外围结合到hcp结构区域的簇会以平均0.45秒的时间分解，而已经形成hcp结构的则相对更加稳定，可能原因是内部的lysenin寡聚体相互之间具有更多的结合位点，更难以分解。

小结：高速AFM成像可用于lysenin形成hcp结构的动态过程的研究。lysenin簇于膜上形成，经过大量的分解\重组和扩散形成hcp结构，随着膜上hcp数量的增多而趋向于稳定。同时，我们还可以获得簇的高度信息，用于表征lysenin与膜的结合以及穿膜通道的形成。

2）膜蛋白的结构形成机制研究

膜联蛋白（Annexin）是于真核细胞的细胞质内普遍存在的一种蛋白，与多种细胞膜功能相关，如胞吞、胞吐以及离子转运等。膜联蛋白在钙离子环境下可结合至磷脂，进行细胞膜修复等作用，但至今对于膜联蛋白-钙离子-磷脂三者的组装与分解的动态过程的研究仍处于空白。

这项研究中，研究人员使用日本RIBM的超高速视频原子力显微镜（HS-AFM）引导了膜联蛋白V（A5）的组装与分解并进行成像，分析了过程中的蛋白结构，动力学和分子间相互作用。

研究人员先将双层脂膜加入含2mM钙离子的缓冲液，再加入A5并用HS-AFM成像。可以观察到A5三聚体在膜上形成了六边形晶格结构（标记1），并在中间含有纵向高度更低的三聚体（标记2）或者空洞（标记3），这与先前使用其他AFM和电镜的结果相一致。 

HS-AFM可以进行每秒几十帧的更高速度的成像。对上图中标记2的区域进行高速成像，三聚体依然保持了相似的尺寸和高度。在高速成像下，研究人员次发现三聚体的方向会发生变化：向上（0°）和向下（60°）。此A5三聚体与其他形成了六边形晶格结构的三聚体相比，分子间相互作用更弱，使其能够改变方向。

传统的AFM和电镜获得的图像是时间或空间的平均图像，无法记录短时间内的变化，因此难以发现三聚体方向的改变。通过HS-AFM的高速实时成像才发现并捕捉到了这一现象。

HS-AFM还可以与微流系统和激光等其他仪器结合，在实验过程中对样品和环境进行更多操作并实时成像，可以对两种A5三聚体的组装与分解进行更加深入、详细的研究。

研究人员使用微流系统可向实验环境加入EDTA,可以降低钙离子含量，使三聚体形成的晶格结构分解，同时，通过控制的流量可以地计算出加入EDTA的含量进行定量分析；整合的高精度紫外激光，可以对钙离子笼锁化合物进行解笼锁操作，使其在实验过程中可以多次反复释放钙离子。

　　

起初，我们可以清晰地观察到晶格结构；277s时缓慢加入40mM EDTA后，晶格结构分解；441s时启动紫外激光，解笼锁发生释放出钙离子，晶格结构重新组装；870s时关闭激光，晶格结构再次开始分解。

进一步提高放大倍数后进行高分辨率成像，可以发现加入EDTA后，非六边形晶格的A5三聚体相对于形成了六边形晶格结构的三聚体分解更快，对于钙离子含量下降更加敏感。

小结：通过HS-AFM的高速、高分辨率成像以及与其他仪器的联用，在体外构建了实时生化反应环境，在对蛋白结构直接成像的同时，发现了构成膜联蛋白结构的两种不同状态的蛋白三聚体的差异，同时证明了钙离子在蛋白组装过程中的必要性。

3）膜蛋白的跨膜运动机制研究

谷氨酸盐跨膜转运蛋白（GltPh）的主要作用是通过跨膜转运谷氨酸盐，将突触间隙的谷氨酸盐浓度保持在兴奋性毒性以下，防止神经元死亡导致神经系统疾病如癫痫、老年痴呆等。

GltPh如右图所示，由一个固定在膜上的三聚体结构域（橙色）和一个转运结构域（蓝色）组成。在有钠离子和谷氨酸的环境下，转运结构域可移动至膜的对侧来转运谷氨酸盐；在无基底的环境下，转运结构域也可以跨膜移动。

之前，GltPh的直接动态成像很难实现，RIBM的超高速视频原子力显微镜（HS-AFM）攻克了这一难关，向我们展示了GltPh的跨膜升降运动。

实验开始前，研究人员将GltPh纯化后与脂类组成的囊泡整合成跨膜结构，并用HS-AFM观察。

在无基底的环境下，GltPh的三聚体结构清晰可见。当每个转运结构域暴露在胞外的部分朝向显微镜的探针，即处于上升（up）状态，突出的部分形成了一个三角形，中间则形成空洞（t=57s）；每个转运结构域也可朝向胞内（t=58s），此时处于下降（down）状态。

环境中单加入钠盐时，GltPh处于上升状态的平均时间为33s，这意味着GltPh仅结合Na 离子时跨膜运动受到抑制。

加入充足的钠盐和谷氨酸，使环境浓度达到饱和后，GltPh处于上升状态的平均时间为 11.1 s，开始进行活跃的跨膜转运活动。

以上的结果证实了，当Na 和谷氨酸同时存在或缺失时，GltPh的跨膜运动相对于仅有Na 时更加活跃，GltPh是Na 和谷氨酸的协同转运载体。

HS-AFM在进行高速成像的同时，保持了很高的空间分辨率，可以清晰地分辨三聚体的每一个结构域，使得我们可以对不同结构域运动之间的关系进行研究。

我们针对一个GltPh三聚体，通过视频统计的数据计算了其处于不同状态（结构域处于上升状态的数量）的概率，结果与使用自由能公式计算出来的概率一致。

进一步对结构域运动的关系进行统计，可以得出三聚体的结构域之间运动是相互立的，这也直接验证了之前的研究结果。

小结：使用HS-AFM获得的高空间&时间分辨率的视频图像，可以准确地反应生物大分子的运动状态，用于定量研究。

这项工作的完成主要借助了日本RIBM公司研发的超高速视频原子力显微镜HS-AFM，HS-AFM突破了传统原子力显微镜“扫描成像速慢”的限制，能够实现在液体环境下超快速动态成像，分辨率为纳米水平。待测样品无需特殊固定，不影响生物分子的活性，尤其适用于生物大分子互作动态观测。推出至今，全球已有100多位用户，发表SCI论文300余篇，其中包括Science, Nature, Cell 等顶级杂志。 

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