应用案例（质量光度计-MP）：质量光度计测量含去污剂的溶液

Mass photometry with detergents

翻译整理：北京佰司特贸易有限责任公司     

去污剂广泛应用于生物化学，但在水溶液中表现出复杂的行为。质谱光度法是研究含去污剂溶液中的生物分子以及评价分子聚集和胶束形成的有效方法。在此，我们描述了去污剂如何影响质谱光度测定，并概述了如何优化涉及去污剂的质谱光度测定实验条件的建议。 

去污剂可用于提取和溶解膜蛋白，防止非特异性结合，或控制蛋白质结晶条件。然而，由于其显著的化学性质和在水溶液中的复杂行为，去污剂的存在显著限制了许多分析技术的下游应用。质谱光度法，一种测量溶液中单个生物分子质量的技术，可以克服这一挑战。与广泛的缓冲液兼容，质谱光度法消除了完全去除去污剂的需要。它还提供了一种快速和直接的方法来确定去污剂如何影响样品溶解度，以及在不同浓度和不同缓冲液中去污剂行为如何变化。

质谱光度法中去污剂的作用

单个去污剂分子不能被质谱光度法检测到，因为它们散射的光的量很大程度上低于检测阈值。尽管如此，去污剂可以在比率质谱光度图像中产生噪声(信号波动)。这种噪声可能是由于水分子在去污剂分子周围形成大的溶剂化壳，去污剂分子在玻璃表面创建动态结构或其他因素，影响玻璃-水界面的折射率。

去污剂影响质量光度测量的另一种方式是，当去污剂在水溶液中的浓度高于所谓的临界胶束浓度(CMC)时，通过胶束的形成。像单个的去污剂分子一样，较小的胶束(低于检测限的胶束)会在质谱光度测量中产生噪声。较大的胶束可以像生物分子一样在质谱光度测量中直接可视化。

然而，许多标准方案要求高浓度的去污剂，这导致胶束的浓度过高，无法通过质谱光度法定量单个胶束的质量;相反，当胶束遇到玻璃-水界面时，可以观察到许多重叠事件。重叠事件会产生一种类似于单个分子和更小的胶束产生的噪声模式，但信号更强。

 

 

总体结果是在比率质谱光度图像中出现随机噪声模式(图1，上面板)，这阻止了对信号在相同范围或更低范围内的大分子的检测，有效地提高了质量检测的下限(表1)。这些噪声模式还会导致伪质谱光度信号，类似于大分子产生的信号。标准的质量光度图像分析将错误地将这些模式解读为大分子降落在表面，如果它们再次出现，则会在直方图中产生一个具有一定表观质量但没有生物学意义的峰值。也会出现一个具有等效、负表观质量和相同高度的镜像峰(图1，图下部)。这种标志性的镜像成像可以用来区分噪声产生的峰和那些代表生物分子落在测量表面的峰。这是因为负质量是由于粒子远离玻璃表面而不是落在玻璃表面上造成的。生物分子的质谱光度测量，例如图1典型去污剂噪声特征上图:单独的PBS缓冲液和两种浓度的清洁剂Tween20。下图:PBS直方图(灰色)与PBS中添加Tween®20的叠加图，浓度低于(0.003 mM，中蓝色)和高于(0.3 mM，深蓝色)CMC。表示了高斯拟合的表观质量和西格玛值。在Onem上测量的值。 

蛋白质，通常产生非常小的负峰或根本没有，因为生物分子与玻璃表面相互作用，只是偶尔离开它。

测量含有去污剂的样品

只有质量显著大于与去污剂噪声峰对应的表观质量的生物分子将通过质谱光度法观察到。因此，较低的去污剂浓度通常会导致较低的质量检测限，以及提高的分辨率和准确性(图2)。因此，建议在可能的最低去污剂浓度下进行测量，在某些情况下，这将对应的质量检测限仍然过大，无法通过质量光度法进行有意义的测量。在这些情况下，如果清洗剂和蛋白质充分结合，滴入式快速稀释程序(框1)可以使质谱光度法在清洗剂浓度低于蛋白质稳定性最低浓度的情况下测量蛋白质。

表1给出了在PBS中稀释的不同去污剂的有效检测限的近似值。这些信息是作为一般指南提供的，但实际的检测限可能会根据所使用的缓冲液的离子强度、pH值和其他特性而变化。因此，建议在没有所关注的生物分子的情况下，通过对溶液进行控制测量，对含去污剂溶液的质量检测限进行个案评估。

蛋白质聚集的筛选。

 

 

图2质谱光度法测量去污剂中的蛋白质。直方图表示仅含0.0025% LMNG的缓冲液的测量值，以及含0.0025%和0.00025% LMNG的缓冲液中10 nM蛋白的测量值。如显示可溶性蛋白(浅蓝色)和聚集蛋白(中蓝色)的比率框架所示，去洗剂的过度稀释可能导致蛋白质聚集。数据由Blanca López Méndez和哥本哈根大学的Vadym Tkach提供。OneMP上测量的值表1对应于去污剂相对浓度的有效低检出限Onel(浅蓝色)和TwoMP(中蓝色)在kDa中最低可检测蛋白质量的估计是基于在各自去污剂浓度(nM灰色梯度)下检测到的噪声峰。去污剂用PBS稀释。CMC以灰色表示。- /A:适用仪器的检测限。

 

 

有些蛋白质只有在一定的去污剂浓度以上才可溶，低于此浓度时才会形成大的聚集体。每种蛋白质/去垢剂组合的最佳条件取决于许多因素，难以预测。因此，应根据具体情况对其进行实验评估。质谱光度法是筛选溶解度条件的一种有利的方法，因为它可以快速完成并且使用最少的样品。在比率质谱光度电影中可以很容易地识别聚集物(图2)。

使用质谱光度法来评估CMC

通常，去污剂在CMC以下产生低质量光度背景，而在CMC以上背景急剧增加。对于形成单一尺寸胶束的去污剂，如DDM (n-十二烷基-3- d -麦芽糖苷)，背景强度可以稳定下来，或者如果胶束尺寸随着浓度的增加而增加，背景强度可以继续增加，就像OG（辛基糖苷）一样（图3）。CMC取决于图3 CMC以上的去污剂行为因去污剂的不同而异。两种不同的去污剂，DDM(深蓝色)和OG（橙色）的质谱测量显示，随着去污剂浓度增加到CMC以上，背景呈s形(DDM) vs线性(OG)增加。近似CMC (PBS)用灰色表示。背景量化为每幅比值图像的对比度标准差，平均超过3000帧。在OneMP上测量的值。

 

 

与缓冲液的pH值和离子强度、生物分子的性质等因素有关。因此，在实验条件下观察到的去污剂CMC可能与该去污剂在水中的CMC有很大的差异。这种变异性在离子去污剂中尤其明显，例如SDS(十二烷基硫酸钠)(图4，上)。去污剂也可以表现出复杂的胶束形成行为。据报道，CH (3-(3-colamidopro)二甲氨基1-丙烷磺酸盐)具有两种不同的CMC(约7和32 mM)，其形成的胶束比第二种CMC大1.8倍(图4，底部)。

在任何给定的实验条件下，监测胶束形成的能力是有价值的，因为它可以使一个人优化去污剂的浓度，使用不多于必要的去污剂。然而，在实践中，测量CMC是困难的，实验通常在去污剂浓度远高于它的情况下进行。质谱光度法为这个问题提供了一个可能的解决方案。通过提供一种快速、方便的方法来评估不同实验条件下的去污剂行为，质谱光度法可以很容易地为任何给定的实验建立最佳参数。

 

 

图4去污剂胶束的形成可能对缓冲液组合物敏感或表现出复杂的行为。上图:使用质谱法测定SDS在水中(蓝色)、0.1倍PBS(灰色)和1倍PBS(橙色)中浓度增加的背景。下图:增加PBS中CHAPS浓度的类似测量。文献中报道的cmc用灰色区域表示。背景量化如图3所示。在Onel上测量的值。

框1:滴入式快速稀释程序

这一简单的程序使质谱光度测量低于蛋白质稳定性所需的去污剂浓度。仅当去垢剂-蛋白质相互作用在测量持续时间(1分钟)内保持稳定且蛋白质不聚集时才能使用。

1. 将不含去污剂的缓冲液装入盖玻片上，找到焦点；

2. 用移液管吸进吸出，在原缓冲液和混合液中加入蛋白和去污剂；

3.该程序应在相同去污剂浓度下对缓冲液进行控制测量后进行，以评估去污剂噪声峰值的表观质量。

 

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