文献转载： 科学家开发出新型高致病性尼帕病毒纳米颗粒疫苗

2024年8月31日，武汉大学病毒学国家重点实验室赵海艳团队和中国科学院武汉病毒研究所邓增钦团队合作在《npj Vaccines》杂志上发表题为“An attachment glycoprotein nanoparticle elicits broadly neutralizing antibodies and protects against lethal Nipah virus infection”的研究论文。本研究以尼帕病毒G蛋白头部域为抗原靶标，成功开发出一种新型的、安全有效的自组装蛋白纳米颗粒疫苗，该疫苗能够诱导抑制多种亨尼帕病毒感染的广谱中和抗体，并对尼帕病毒感染的仓鼠提供完全保护。

Zhou, D. et al.

npj Vaccines 9, 158 (2024).

https://doi.org/10.1038/s41541-024-00954-5

蛋白质的热稳定性是指蛋白质多肽链在温度影响下的形变能力，主要体现在温度改变时多肽链独特的化学特性和空间构象的变化，变化越小热稳定性越高。蛋白质的热稳定性受到不同温度、pH值、离子强度等外界因素的影响，在生物技术、药物研发以及食品工业等领域，具有重要意义。

蛋白质变性温度是生物学家们研究蛋白质的热稳定性的一个重要的概念，是指蛋白质在特定温度条件下受到热力作用时，其结构发生变化的温度点，一般温度较高时，蛋白质从稳定的三维结构变化成松散的无序结构。蛋白质的热稳定性一般使用热变性中点温度（Tm）来表示，即蛋白质解折叠50% 时的温度。

01 前言

尼帕病毒（NiV）是一种负义单链RNA病毒，最初是在1998年至1999年马来西亚和新加坡爆发期间分离和鉴定的。NiV感染可导致严重的脑炎和呼吸道疾病，病死率高达75%。另外在幸存者中也观察到长期神经系统疾病和NiV感染复发。目前，还没有批准的可用于人类的疫苗或治疗方法。NiV编码一种病毒膜蛋白：糖蛋白（G），G蛋白位于病毒表面，负责受体识别和结合，受体结合后，G蛋白经历一系列构象变化，完成与靶细胞的膜融合，从而帮助病毒进入靶细胞并引发感染。此外，许多中和和保护性抗体主要针对G蛋白，表明G病毒蛋白是疫苗开发的关键抗原。最近已经开发了多种针对NiV感染的疫苗平台，包括亚基疫苗、mRNAs、病毒样颗粒（VLP）、病毒载体疫苗和DNA疫苗，但还没有对自组装纳米粒子平台进行NiV感染评估。

02 摘要

作者设计了一种基于铁蛋白的自组装纳米粒子，在表面显示NiV G头部结构域（NiV G-铁蛋白，NiV G-ferritin），并评估了可溶性NiV G头结构域（NiV sG）或NiV G-铁蛋白引发的免疫反应，并且通过一系列研究数据表明NiV G铁蛋白是一种安全有效的尼帕病毒感染候选疫苗。

03 结果

NiV G纳米颗粒免疫原的设计和生成先前的研究表明，受体结合位点位于NiV G头部结构域（Niv G head domain）上，大多数中和抗体和保护性单克隆抗体都以该结构域为靶点。为了在铁蛋白（ferritin）表面均匀显示NiV G头部结构域，将NiV G的C端与铁蛋白的N端延伸融合，将信号肽融合到NiV G头部结构域的N端，在Expi293F细胞中进行真核分泌表达。作者通过负染电子显微镜（Negative stain EM）检查了ferritin和NiV G-ferritin的整体结构。Negative stain EM图显示，ferritin和NiV G-ferritin都形成了分散的球形颗粒，没有聚集的迹象，与单独的ferritin相比，NiV G-ferritin的表面呈尖峰状。

作者进一步借助蛋白稳定性分析仪PSA-16，通过差示扫描荧光法（Differential scanning fluorimetry，DSF）原理进行NiV G-ferritin和NiV sG的热稳定性分析，结果表明，NiV G-ferritin和NiV sG表现出相似的热稳定性，Tm为~65°C，表明NiV G和ferritin的融合对其结构稳定性没有显著影响。

由于NiV G-ferritin可以诱导强大的体液免疫反应，研究者还从NiV G-ferritin免疫小鼠体内筛选、制备了一批单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）。在分离的27种mAbs中，25种mAbs可以有效抑制水疱性口炎病毒（VSV）为骨架的NiV假病毒的感染，其抑制50%的NiV假病毒感染所需要的浓度（IC50）低于10 ng/mL。表位竞争分析发现，筛选得到的27个mAbs可以识别NiV G蛋白上4个不同的抗原表位，包括2个新的此前未被报道的表位。最后，研究者在尼帕病毒感染的致死模型（叙利亚金黄仓鼠）上评估了NiV G-ferritin诱导的免疫反应和保护效果。研究发现给与仓鼠2针或者3针的NiV G-ferritin后，仓鼠体内均产生了高中和活性的血清，且接种2次或者3次均能够帮助仓鼠100%的抵抗致死剂量NiV的攻击。研究者进一步检测了3针疫苗接种仓鼠体内的病毒RNA含量，结果发现，仓鼠的肺脏、脑和脾脏中均未检测到病毒RNA，表明三剂NiV G-ferritin完全抑制了病毒在仓鼠肺部、大脑和脾脏的复制。

04 方法

克隆、蛋白表达和纯化

编码NiV-M的基因G (NP_112027.1)和F (NP_112026.1) NiV-B的基因(AAY43916.1)和F (AAY43915.1)， G (NP_047112.2)和F (NP_047111.2) of hev,G(YP_009094095.1) of mojv,G(UUV47206.1) of LayV，幽门螺杆菌铁蛋白(WP_000949190.1)和牛蛙铁蛋白 ESQVRQQF基因片段(ESQVRQQF)的密码子经Tsingke优化合成 niv - m、NiVB、 将HeV分别克隆到哺乳动物表达载体中 用于生成假病毒。

负染色电子显微镜

纯化后的纳米颗粒依次稀释至800/400/200/100/50 nM 然后将10 μL的样品吸附在300目铜网(北京 大集科易科技有限公司(D11023)静置1 min，然后，将多余溶液 被滤纸吸走了。网格用2%铀酰染色 醋酸盐浸泡30 s，吸去多余的溶液。图片是 通过透射电子显微镜(JEOL, JEM-1400plus)收集 或Talos L120C (Thermo Scientific)电子显微镜。

动态光散射(DLS)

蛋白用0.22 μm滤镜过滤，稀释至约 0.5mg/mL，使用含有20mMTris-HCl pH 8.0和150mM的缓冲液 生理盐水。然后，将样品装入微比皿中测量 Zetasizer纳米ZSP的水动力直径和多分散性仪器(马尔文帕analytical)。每个样品重复三次 在25°C下，每次平行重复持续60 s。水动力的 对样品的直径和多分散性指数进行了分析(Malvern Panalytical)。

差示扫描荧光法

使用PSA-16仪器（北京佰司特科技有限责任公司）通过差示扫描荧光法（Differential scanning fluorimetry，DSF）测定靶蛋白的热稳定性。将样品稀释至0.5mg/mL，并将20μL稀释后的样品装入石英玻璃管中。使用23至97°C的线性温度扫描，以1°C/min的加热速度实时动态测量靶蛋白在280nm紫外激发下的330nm和350nm的荧光强度（F）。根据F350nm/F330nm曲线的斜率计算热变性中点温度（thermal transition midpoint，Tm）。每个样品平行测量四次。

多角度光耦合的粒径排除色谱法散射(SEC-MALS)

每个样品100 μL体积(NiV g -铁蛋白0.5mg/mL, 2mg/ mL) mL (NiV sG)注入WTC-030S5色谱柱(Wyatt Technology， Santa Barbara, CA, USA)，等温运行0.5 mL/min 以20mMTris-HClpH8.0和150mmnacl为移动端 阶段。一个MALS检测器(DAWN®)和一个折射率检测器(RI) (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, USA)串联到 SEC系统上的紫外线探测器。牛血清白蛋白(BSA 采用Scientific)对静态光散射探测器进行归一化处理。光 散射，差折射率(dRI)测量，和分子 采用ASTRA软件(6.1.2.84)(Wyatt Technology)。

酶联免疫吸附试验(ELISA)

采用ELISA法检测NiV g -铁蛋白的抗原性。简单地说,96 - 用3 μg/mL的NiV在4℃下包被ELISA板(康宁)过夜 sG或NiV g -铁蛋白涂层缓冲液(0.1Mcarbonate, pH9.6)。后四个 用PBS-T(pbs含0.05%Tween 20)冲洗1次后，所有的孔都被堵塞 用50 μL阻断缓冲液(PBS-T中1% BSA)在37℃下作用2 h。后 阻断，NiV G单抗HENV-32, HENV-26, nAH1.3，抗狂犬病 病毒单抗RVC20(阴性对照)从5 μg/mL开始依次稀释 加入板中，37℃孵育2 h PBS-T洗涤4次，然后加入HRP结合的山羊抗人抗体 IgG(1∶20000稀释，ab克隆，AS002)在37℃下保存1 h。盘子 用50 μL/孔的单组份TMB显色剂冲洗染色 溶液(NCMBiotech)在37°C下保存10-30分钟。底物反应 加入50 μL/孔的1M HCl，吸光度为 在450nm处测量(OD450)。对于血清结合滴度检测，我们 NiV-M、NiV-B、NiV-B的G头蛋白 将HeV、LayV和MojV包被在ELISA板上，HRP偶联 采用山羊抗小鼠IgG(1∶8000稀释，ab克隆，AS003)。

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05 总结

综上，本研究成功设计了一种以NiV G蛋白头部域为抗原靶标，以ferritin为展示平台的新型纳米颗粒候选疫苗，并分离了一批具有潜在治疗效果的单克隆抗体。研究为深入理解尼帕病毒G蛋白的免疫原性提供了新的见解，NiV G-ferritin有望进一步开发为亨尼帕病毒的广谱候选疫苗，为全球公共卫生安全提供新的防护策略。

武汉大学病毒学国家重点实验室赵海艳研究员和中国科学院武汉病毒研究所邓增钦研究员为该论文的共同通讯作者。武汉大学生命科学学院博士研究生周丹、已毕业的硕士研究生程娆以及中国科学院武汉病毒研究所高级实验师姚艳丰博士为论文的共同第一作者。

该研究得到了国家重点研发计划项目、湖北省卫生健康委青年人才项目和中国科学院院级人才项目的资助，并获得武汉国家生物安全实验室和武汉病毒学国家重点实验室的支持。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41541-024-00954-5

作者借助北京佰司特科技有限责任公司自主研发的蛋白稳定性分析仪PSA-16，通过差示扫描荧光法（Differential scanning fluorimetry，DSF）原理进行NiV G-ferritin和NiV sG的热稳定性分析，结果表明，NiV G-ferritin和NiV sG表现出相似的热稳定性，Tm为~65°C，表明NiV G和ferritin的融合对其结构稳定性没有显著影响。

北京佰司特科技有限责任公司 (httpswww.best-sciences.com)

类器官串联芯片培养仪-HUMIMIC；灌流式细胞组织类器官代谢分析仪-IMOLA；光片显微镜-LSM-200；

蛋白质稳定性分析仪-PSA-16；单分子质量光度计-TwoMP；超高速视频级原子力显微镜-HS-AFM；蛋白质相互作用分析仪Fluidity One-M；

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