文献转载： 科学家开发出新型尿酸生物传感器

 

齐鲁工业大学（山东省科学院）生物研究所的科研工作者于 2025年4月在《International Journal of Biological Macromolecules》期刊上发表“Structural-guided high stable fusion urate oxidase engineering to self-assemble with cellulose modified electrode for enhanced uric acid sensing”论文。

Xingbao Wang, Weili Gong, Yunlong Xue, Yi Yu, Xiaozhen

Huang, Yue Shao, Xuan Li, Xin Wang, Chunyu Song, Binglian

Wang, Lihe Zhang, Yaohong Ma

PII: S0141-8130(25)04227-8

DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2025.143675

Reference: BIOMAC 143675

To appear in: International Journal of Biological Macromolecules

Received date: 13 December 2024

Revised date: 17 March 2025

Accepted date: 28 April 2025

 

 

摘要

在固定化尿酸氧化酶（UOX）的高稳定性和保留的催化活性是实现尿酸（UA）精确传感器的关键。本研究开发了一种基于自组装固定化UOX的电化学UA生物传感器，通过在纤维素修饰电极上融合碳水化合物结合模块（CBM）来促进UA的检测。借助计算结构导向的酶工程策略，证明了N端CBM3融合的结构稳定性优于C端融合的CBM3或CBM2。进一步删除了预测对CBM3-UOX结构稳定性有害的CBM3 N端残基（P2VSG5）和连接区残基（K158EPMSN163），构建了CBM3-Δ10aa-UOX，与戊二醛交联的UOX生物传感器（0-0.375 mM，5天）相比，显著提高了UA生物传感器的可靠性，在0至0.625 mM UA范围内表现出线性关系，R2 > 0.99，可持续20天。此外，通过野生型UOX和CBM3-Δ10aa-UOX的共固定化（0-0.875 mM，> 34天，R2 > 0.99），探究了融合UOX在初始阶段电流增加的机制，并将其归因于UOX亚基之间的相互作用和连接肽断裂，进一步证明了CBM3-Δ10aa-UOX连接肽的增强稳定性可延长电流增加过程并提高工作寿命。本研究强调了自组装固定化在推进生物传感器领域的有效性，并为类似多聚体生物传感器的进化提供了稳健的策略。

 

01 介绍

尿酸（UA）是一种在血清和尿液等生物体液中广泛存在的关键含氮化合物，是嘌呤代谢的主要终产物。健康个体血清中UA的正常水平分别为成年男性约0.21-0.43 mM和成年女性约0.15-0.36 mM，而在痛风患者中，UA浓度可高达1.49-4.46 mM。生物体液中UA水平的异常可提示痛风、代谢综合征和肾脏疾病等疾病，使其成为检测嘌呤代谢相关疾病的有用生物标志物。因此，生物体液中UA的快速可靠检测通常对其诊断和治疗至关重要。

目前，已开发出多种UA测定方法，包括高效液相色谱法（HPLC）、分光光度法、离子色谱法、HPLC/同位素稀释质谱法（ID-MS）和电化学生物传感方法。在这些方法中，基于尿酸氧化酶（UOX或尿酸酶，EC 1.7.3.3）氧化还原催化的电流型酶生物传感器因其简单性、灵敏度、特异性和快速响应而受到广泛研究关注。UOX反应方程式如下：UA + 2H2O + O2 → 尿囊素 + H2O2 + CO2。在生物传感过程中，固定在电极上的UOX与UA反应，消耗O2并产生H2O2。减少的O2或氧化的H2O2与UA浓度成正比，氧化或还原信号可通过换能器和电子放大器转换并放大为可读的物理信号。因此，固定化UOX的高稳定性和保持的催化活性是实现UA精确传感的关键。

在先前报道的研究中，已利用不同类型的酶固定化技术构建电流型UA生物传感器。物理吸附和包埋法常用于UOX固定化，但其吸附过程的结合力较弱，易受环境变化影响，从而降低相应生物传感器的操作和储存稳定性。UOX包埋通常使用聚苯胺（PANi）和聚吡咯等聚合物实现。然而，固定化酶从这些聚合物中的泄漏可能影响其稳定性。使用戊二醛或碳二亚胺等双功能试剂在酶与载体或牛血清白蛋白（BSA）之间形成稳定共价键的共价结合和交联方法也是化学固定UOX的常用方法，可避免酶的解吸和泄漏。然而，共价结合法引起的广泛酶失活和低重复性限制了其在生物传感器中的应用。最近，亲和吸附法已被证明是一种有前景的酶固定化策略，可提高酶生物传感器的性能。此外，通过基因工程将来自家族2的碳水化合物结合模块（CBM2）与葡萄糖氧化酶融合，以促进葡萄糖传感性能。然而，UOX的结构和催化机制与葡萄糖氧化酶完全不同，因此探索构建稳定且具有活性的CBM融合UOX作为UA生物传感元件仍然至关重要。

UOX是一种功能性四聚体桶状结构，其活性位点由来自两个单体的界面残基形成。每个单体包含两个具有ββααββ反平行超二级结构的相同结构域，称为隧道折叠结构域。某些弱相互作用（非共价键、次级键），包括范德华力、氢键、盐键（解离键）和疏水相互作用，参与稳定四级结构。此外，亚基之间形成的紧密界面处极性和疏水基团的互补排列促进了特定亚基的关联。在UOX催化过程中，采用无辅因子方式促进和控制O2化学，提出了类似于黄素依赖性氧化酶或黄素依赖性单加氧酶的不同催化机制，但其作用机制尚未完全阐明。由于UOX的多亚基依赖性催化活性和模糊的催化机制，过去几十年中关于性能改进的工程化UOX的研究报道较少。因此，构建稳定的基因融合UOX是一项重大挑战。

串联融合是构建合成融合蛋白的一种流行且可行的策略。使用该策略获得理想的融合蛋白时，应仔细考虑两个不可或缺的要素：融合伙伴之间的最佳结构域放置顺序和选择合适连接子将蛋白质结构域连接在一起。融合蛋白的盲目设计可能导致多种不良后果，包括结构域错误折叠、蛋白质产量低和生物活性降低。由于专门用于蛋白质结构预测和蛋白质合理设计的计算程序（如AlphaFold2、PROCHECK、AutoDock Vina和GROMACS ）的显著发展，可以更好地理解融合蛋白结构并避免许多不良结果。

 

02 材料与方法

在本研究中，我们借助结构引导的酶工程策略构建了一系列CBM融合尿酸氧化酶，并探索了影响融合UOX作为生物传感元件稳定性的关键因素，结果表明CBM3 N端连续残基（P2、V3、S4、G5）和158至163位（K158EPMSN163）域间锚定区域对CBM融合UOX结构稳定性的关键作用。删除不稳定残基后，UA生物传感器的可靠性显著提高。本研究有助于合理构建具有可调和可预测特性的融合UOX，并为制造优异的UA生物传感器提供了理想候选者。

使用北京佰司特科技有限责任公司生产的 PSA-16 蛋白稳定性分析仪对目标蛋白的热稳定性进行了评估。首先将样品稀释至 0.5 毫克/毫升的浓度。然后，将 20 微升稀释后的样品置于石英玻璃管（产品编号 LG-002，同样来自北京佰司特科技有限责任公司）中。采用线性温度扫描法，测量 330 nm和 350 nm处的内源性蛋白质荧光强度。温度范围为 23 至 97  ℃，升温速率为每分钟 1 ℃。根据 F350/F330 曲线的斜率计算出热变性中点温度（Tm）。每个样品均重复测量四次。

为了对所有UOXs进行更全面的结构表征，我们采用了差示扫描荧光法（DSF）[34]进行热稳定性测定。如图S7所示，UOX-CBM3和UOX-CBM2的峰形更为不对称，尤其是UOX-CBM2，这表明CBM与UOX断裂诱导了多个结构域的协同变性。相比之下，CBM3-Δ10aa-UOX的DSF峰最为对称且最窄，验证了其结构稳定性，这与分子动力学模拟和SDS-PAGE分析的结果一致。

 

03 结果与讨论

3.1 合成CBM融合UOX的设计与构建  

我们提出了一种假设，即将CBM与UOX融合将能够控制UOX在电极上的固定方向，并提升生物传感器的性能。然而，构建令人满意的CBM融合酶具有挑战性，因为CBM3（17.67 kDa）或CBM2（14.83 kDa）的分子量约占UOX（34.47 kDa）的1/2，这可能导致底物结合或多亚基自组装的空间位阻。因此，选择多肽链中融合伙伴的正确顺序至关重要，这有助于双功能域的定位和功能发挥。  

我们利用专门用于结构预测的计算程序（包括AlphaFold 2、AlphaFold 3和PROCHECK）评估了CBM3或CBM2与UOX的N端或C端融合的结构稳定性。结果显示，三种融合酶（CBM3-UOX、UOX-CBM3和UOX-CBM2）的结构预测置信度（通过预测局部距离差异测试pLDDT和预测TM-score pTM表示）存在差异（图1A-D）。CBM3-UOX的pLDDT和pTM得分最高，表明其单体（pLDDT）和多聚体（pTM）结构可能更为合理，且N端CBM融合优于C端融合。  

 

此外，我们还通过PROCHECK生成的Ramachandran图对不同的UOX模型进行了验证。PROCHECK分析显示，野生型UOX模型中88.8%的残基位于最有利区域，10.5%位于额外允许区域，两个残基（H306和N217）分别位于宽松允许区域（0.4%）和不允许区域（0.4%）。对于三种CBM融合UOX（CBM3-UOX、UOX-CBM3和UOX-CBM2），位于最有利区域的残基总数均超过90%，表明模型质量较高，但CBM3-UOX、UOX-CBM3和UOX-CBM2分别有1.2%、1.7%和1.6%的残基位于宽松允许和不允许区域，表明CBM融合UOX的问题区域有所增加，尤其是UOX-CBM3和UOX-CBM2。此外，问题区域残基的位置与蛋白质结构的比对显示，UOX的N端（UOX-CBM3和UOX-CBM2）的Asn（N3）残基或CBM3-UOX中的N163残基，以及CBM3的N端（CBM3-UOX）的Val（V3）、Ser（S4）和Asn（N6）残基，或UOX-CBM3中的V305、S306和N308残基可能在CBM融合UOX的构建中不稳定。  

随后，我们利用大肠杆菌BL21(DE3)进行异源表达，并通过Ni2+亲和层析纯化野生型UOX和三种工程化CBM融合UOX。将纯化后的酶分别与纤维素（UOXs/C）或溶解纤维素的水（UOXs/W）混合，离心收集上清液并通过SDS-PAGE检测。图1A-D显示，在UOXs/W的泳道中成功检测到具有预测分子量的目标酶分子，且CBM融合的UOX能够与纤维素结合，而野生型UOX则不能。此外，在CBM3-UOX条带下方观察到多个额外条带。为了排除额外条带出现的偶然性，我们将酶在室温下保存72小时后再次进行SDS-PAGE检测。结果显示，对于UOX-CBM3和UOX-CBM2，融合酶对应的条带消失，出现了与野生型UOX和CBM3或CBM2分子量相同的两个额外条带（图S2A和B），表明UOX-CBM3和UOX-CBM2可能在两个域之间的连接区（V305、S306、N308）断裂，而CBM3-UOX也检测到相同的额外酶条带（图S2C）。这些结果进一步证明，CBM在N端融合比在C端融合更为稳定，这与我们的AlphaFold分析结果一致。 

随后，我们通过液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）对CBM3-UOX的泳道进行鉴定，结果显示，在泳道2和3中，CBM3特异性肽段的数量明显减少（图S2C），表明额外条带是CBM3-UOX在推测的不稳定位置（N163、V3、S4、N6）断裂释放的UOX，这与我们的Ramachandran图分析一致。总体而言，我们的结果表明，需要对CBM3（N端V3、S4和N6）和连接区（N163）进行进一步的序列和结构优化，以获得更稳定的融合UOX。  

3.2 基于计算方法的CBM3-UOX序列和结构优化  

基于我们之前的分析和CAZy数据库中CBM3的序列比对，我们发现，在CBM3家族的特征序列中，N端的P2、V3、S4和G5残基以及C端的K157、E158和P159残基在大多数CBM中经常缺失，其中包括CBM3 N端预测的不稳定残基。因此，我们利用PDB ID为4B9F的CBM3成员替换用于构建CBM3-Δ7aa-UOX的CBM3。图2A显示，Ramachandran图中不合理残基的数量明显减少，表明融合酶的稳定性有所提高。我们对酶在室温下保存3天前后的SDS-PAGE分析结果显示，酶的完整性确实有所提高，但仍有一部分酶被分解为UOX和CBM3。我们推测这种不稳定性可能是由连接区残基（N163）引起的。因此，我们从CBM3-Δ7aa-UOX中依次删除了UOX N端的M161、S162和N163残基，并将其命名为CBM3-Δ10aa-UOX。  

分子动力学（MD）模拟是一种强大的工具，能够再现蛋白质在其生物环境中的真实行为，并计算其分子轨迹随时间的变化，从而提供与蛋白质构象和变化相关的全面信息，可用于评估生化和结构参数。通过MD模拟，我们比较了CBM3-UOX和CBM3-Δ10aa-UOX的结构参数差异，包括均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）、疏水溶剂可及表面积（SASA）、回转半径（Rg）、主成分分析（PCA）、残基交叉相关（Rcc）和氢键数量。  

 

图2B显示，两种酶的RMSD模式不同，CBM3-UOX的结构波动较大，并在约70 ns时达到RMSD值的平台期，平衡值约为1.5 nm。相比之下，CBM3-Δ10aa-UOX的结构构象更为稳定，在约20 ns时达到平衡，平均RMSD值为0.8 nm。据报道，较小的RMSD代表更稳定的蛋白质结构，因此这一结果表明CBM3-Δ10aa-UOX的稳定性有所提高。此外，CBM3-Δ10aa-UOX的Rg和SASA值较低（图S3A-D），反映了优化后UOX的紧凑和有序结构。氢键是CBM与纤维素之间的关键相互作用，如图S3E和F所示，CBM3-Δ10aa-UOX和CBM3-UOX的氢键数量相似，表明优化后的序列未影响其与纤维素的结合能力。此外，我们进行了PCA分析（图S4A-B）以更好地了解残基优化对融合UOX稳定性的影响。前两个主成分（PC1和PC2）分别占总轨迹方差的82.3%和79.1%，能够代表酶的基本运动。图S4C-D显示了PC1和PC2的吉布斯能量景观投影，CBM3-UOX的聚类松散且随机，而CBM3-Δ10aa-UOX的聚类紧凑且集中，进一步表明CBM3-Δ10aa-UOX的结构相对稳定。  

随后，我们计算了不同位置氨基酸残基的动态相关性。图S5显示，氨基酸残基之间的正相关（协同运动）和负相关（反协同运动）分别用蓝色和粉色表示。与CBM3-UOX相比，CBM3-Δ10aa-UOX中CBM3（1-153）、连接区（152-162）和UOX（163-458）的正相关残基数量增加，位于150-250区域的残基与其他区域的负相关强度明显降低。据报道，协同运动有利于结构的紧凑性，因此本研究中观察到的CBM3-Δ10aa-UOX正相关相互作用的增加反映了我们序列优化过程的有效性。

在本研究中，我们借助结构引导的酶工程策略构建了一系列CBM融合尿酸氧化酶，并探索了影响融合UOX作为生物传感元件稳定性的关键因素，结果表明CBM3 N端连续残基（P2、V3、S4、G5）和158至163位（K158EPMSN163）域间锚定区域对CBM融合UOX结构稳定性的关键作用。删除不稳定残基后，UA生物传感器的可靠性显著提高。本研究有助于合理构建具有可调和可预测特性的融合UOX，并为制造优异的UA生物传感器提供了理想候选者。

为了对所有 UOX 进行更全面的结构表征，我们使用差示扫描荧光法（DSF）[34] 进行了热稳定性测定。如图 S7 所示，UOX-CBM3 和 UOX-CBM2 的峰形更不对称，尤其是 UOX-CBM2，这表明由于 CBM 和 UOX 的断裂，多个结构域协同变性。相比之下，CBM3-Δ10aa-UOX 的差示扫描荧光（DSF）峰最对称且最窄，这证实了其结构稳定性，正如分子动力学（MD）模拟和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析所表明的那样。

均方根涨落（RMSF）反映了每个氨基酸残基相对于参考位置随时间变化的平均偏差，这是一种评估蛋白质局部动态趋势的有效方法。一般而言，RMSF值越大，表示灵活性越高。图2B显示，CBM3-UOX中残基的移动性显著较大，尤其是CBM残基。在CBM3-UOX中，CBM的最大RMSF值约为1.5 nm，而在CBM3-Δ10aa-UOX中，该值小于0.5 nm。此外，CBM3-Δ10aa-UOX中UOX部分具有较大移动性的残基数量显著减少。我们的结果表明，删除的残基可能对融合UOX的灵活性和稳定性产生重大影响。进一步地，为了研究灵活性的降低是否影响纤维素结合能力，我们计算了分子动力学模拟最后10 ns的自由结合能，结果显示两种酶的平均自由结合能相似（约–40 Kcal/mol，图2B），表明结构改变对纤维素结合力的负面影响极小。

此外，我们对重组CBM3-Δ10aa-UOX在室温下保存3天前后的SDS-PAGE分析表明，优化后的UOX稳定性显著提高，除目标酶外未检测到额外条带，且CBM3-Δ10aa-UOX能够完全结合纤维素（图2C）。此外，CBM与纤维素的结合能力不受血液中葡萄糖的影响（图S6）。这一结果与我们的分子动力学模拟结果一致，反映了工程化CBM融合UOX的更高稳定性。

为了提供所有UOX的更全面结构表征，我们使用差示扫描荧光法（DSF）进行热稳定性测定。如图S7所示，UOX-CBM3和UOX-CBM2的峰形更为不对称，尤其是UOX-CBM2，这表明CBM和UOX断裂诱导的多结构域协同变性。相比之下，CBM3-Δ10aa-UOX的DSF峰最为对称且最窄，验证了其结构稳定性，这与分子动力学模拟和SDS-PAGE分析结果一致。

 

3.3 酶活性稳定性分析  

对修饰后尿酸氧化酶（UOXs）的酶活性变化进行了分析。通过在生物传感器应用条件下（24°C，pH 8.0）孵育酶，并在2、4、6、8和10小时取样进行酶活性测定，评估了UOX及五种融合UOX的酶活性稳定性。图3A显示所有UOX均表现出良好的酶活性稳定性，这有利于稳定的尿酸催化。此外，CBM3-UOX和CBM3-Δ10aa-UOX的酶活性分别约为UOX的75%和25%。  

为了探究CBM3-UOX和CBM3-Δ10aa-UOX酶活性下降的原因，分析了UOX、CBM3-UOX和CBM3-Δ10aa-UOX活性位点中距离尿酸（UA）分子约4 Å的氨基酸残基。图3B显示，在UOX四聚体中检测到分布在两个亚基中的九个氨基酸残基（K14、A58、T59、D60；F159、L170、R176、H251、F253），且UA的O6、N7和O8分别与D60（-COOH）、K14（-NH2）、T59（-OH）和T59（-NH）形成氢键。当CBM3与UOX融合时，在修饰后的四聚体中，CBM3在A和D或B和C亚基中的方向相反，且距离UA分子约4 Å的氨基酸残基数量显著增加（Y172、V216、V217、V218、T219、D220；F319、L330、R336、L382、Q383、N409、I439、H411），但仅UA的O2和O6分别与Q383（-CONH2）和T219（-NH）通过氢键相互作用（图3C）。然而，当CBM3-UOX进一步改造为CBM3-Δ10aa-UOX时，CBM3在A和B或C和D亚基中的方向相同，与CBM3-UOX不同，且距离UA分子约4 Å的氨基酸残基（Y162、V206、V207、V208、T209、D210；F309、L320、R326、A371、L372、Q373、N399）与CBM3-UOX相似，但H401和I429残基缺失，并新增了A371残基。此外，检测到UA的O8、O6、N1和O2分别与T209（-OH）、D210（-NH2）、Q373（-CONH2）、Q373（-NH2CO）和L372（-CONH）形成氢键相互作用（图3D）。 

 

据报道，AgUricase四聚体在亚基A与D、B与C、A’与D’及B’与C’的界面处形成四个活性位点。UA底物通过与一个亚基中的Arg180（R180）、Leu222（L222）和Gln223（Q223）以及相邻亚基中的Thr67*（T67*）和Asp68*（D68*）的相互作用紧密锚定，His251（H251）参与双氧分子的质子化，而Lys22*（K22*）和T67*参与质子转移。在本研究中，野生型UOX中的K14、T59、D60、R176、L170和H251分别对应于AgUOX中的K22、T67、T68、R180、L222和H251。当CBM3与UOX融合（CBM3-UOX）时，参与K10-T57-H256催化三联体形成的K14残基未位于UA分子约4 Å范围内，但检测到与UA结合相关的多个残基，如Q383和L382。这一现象在CBM3-Δ10aa-UOX中更为显著，K14和H251残基缺失，但更多残基与UA形成氢键相互作用。周围残基的变化可能影响双氧分子、UA及催化残基之间的质子转移，这可能是CBM3-UOX和CBM3-Δ10aa-UOX酶活性下降的原因。  

随后，我们评估并比较了UOX、CBM3-UOX和CBM3-Δ10aa-UOX对UA的催化常数（Km和kcat）。Km和kcat值的顺序为：UOX（Km 1.638 mmol/L，kcat 8.20 ×10^4 s^-1）> CBM3-UOX（Km 1.5 mmol/L，kcat 5.70 ×10^4 s^-1）> CBM3-Δ10aa-UOX（Km 1.215 mmol/L，kcat 2.73 ×10^4 s^-1）（图S8）。与野生型UOX相比，修饰后的UOX变体具有更低的Km和kcat值。这表明，如上述分子动力学模拟分析所示，CBM的融合可能增强了与UA的结合能力，但这种结合能力的提升可能影响底物释放，最终导致反应速率下降。

3.4 不同UOX修饰的纤维素载体微观结构 

未经修饰（图4A）和经不同固定化UOX修饰（图4B-4G）的纤维素膜的扫描电镜（SEM）图像显示，未经修饰的纤维素膜由高度交联的葡聚糖纤维组成，纤维直径范围为0.1–0.2 μm，并存在空腔结构。这种微观结构使纤维素膜表现出优异的氧气分子、水分子和尿酸（UA）分子渗透性。当将等量的各类UOX滴加至纤维素膜上时，观察到不同的形态变化。与未修饰的载体相比，添加野生型UOX后，其形态未发生显著变化，这表明野生型UOX无法在缺乏交联剂的情况下直接固定于纤维素膜上。然而，当添加CBM融合UOX时，可清晰观察到葡聚糖纤维上出现酶斑点或酶簇，这反映了CBM融合UOX通过CBM与纤维素纤维的直接附着成功固定于纤维素膜上。尽管直径约为70 Å的单个UOX分子在SEM图像中不可见，但纤维上观察到的凝聚斑点或酶簇以及后续章节中展示的电化学响应均证明了融合UOX的固定化。 

 

3.5 UOX修饰电极的电化学测量 

本研究构建的UA生物传感器基于UOX选择性氧化UA生成尿囊素、H2O2和CO2，同时消耗溶解氧。释放的H2O2可通过铂电极检测。在UA的酶促氧化过程中，铂电极作为H2O2传感器监测H2O2的生成量。野生型UOX和CBM融合UOX分别通过戊二醛交联和CBM亲和吸附固定于纤维素膜上（图4H）。通过连续改变UA浓度进行循环伏安（CV）测量，以表征固定化UOX的电催化活性。图S9显示，所有修饰电极在UA检测中均表现出明显的梯度响应，并在+0.6 V处观察到氧化还原波，这可能归因于酶促反应释放的H2O2的氧化还原电位，如先前研究[3]所述。为进一步提供UOX固定化的确凿证据，采用电化学阻抗谱（EIS）分析电极-电解质界面的电子传递动力学并测量电荷转移电阻（Rct）值。如图S10所示，与裸铂电极的Rct值（294.6 Ω）相比，当纤维素膜固定于铂电极上时，Rct值上升至396.9 Ω。此外，当添加UOX或CBM融合UOX至纤维素膜上时，Rct值显著增加。由于纤维素导电性较差，固定化纤维素膜的电极Rct值高于裸电极。此外，由于酶通常为绝缘体，添加酶后Rct的增加直接证明了UOX在纤维素修饰电极上的成功固定化。因此，EIS数据与CV测量结果共同为UOX在电极上的成功固定化及其对UA的电催化活性提供了强有力的电化学证据。 

为进一步定量评估UOX生物传感器的传感性能，在PBS溶液（pH 8.0）中以0至1.25 mM的不同浓度梯度UA样品为对象，在规定时间间隔内通过评估+0.6 V处的电流-时间（i-t）响应进行UA动态测量。如图5A1-D1所示，在不同天数下，UOX、CBM3-UOX、CBM3-Δ7aa-UOX和CBM3-Δ10aa-UOX修饰电极的i-t测试电流随UA浓度增加而增加。此外，计算了每日UA浓度与电流差值（ΔI）之间的线性相关性（图5A2–D2）。结果显示，UOX、CBM3-UOX、CBM3-Δ7aa-UOX和CBM3-Δ10aa-UOX修饰生物传感器的工作寿命分别为3、6、7和20天（相关系数R2 >0.99），表明N端CBM融合UOX修饰生物电极的稳定性优于野生型UOX。然而，C端CBM融合UOX未获得稳定的i-t曲线，表现出极差的线性响应、重现性和稳定性（图S11），这可能归因于UOX-CBM2和UOX-CBM3的断裂特性，如前述章节所述。 

CBM3-Δ10aa-UOX修饰生物传感器表现出最佳稳定性，其在0至0.625 mM UA范围内线性良好（R2 >0.99），可持续20天。根据电流与浓度的校准曲线计算，CBM3-Δ10aa-UOX生物传感器的灵敏度和检测限（LOD）在第20天分别为2.13 × 103 μAmol–1Lcm–2和0.010 mM（S/N = 3），优于第5天的UOX生物传感器[0–0.375 mM, 1.26 × 103 μAmol–1Lcm–2, 0.014 mM (S/N = 3)]、第6天的CBM3-UOX生物传感器[0–0.50 mM, 1.58 × 102 μAmol–1Lcm–2, 0.106 mM (S/N = 3)]和第7天的CBM3-Δ7aa-UOX生物传感器[0–0.75 mM, 2.18 × 103 μAmol–1Lcm–2, 0.012 mM (S/N = 3)]。这些结果均证明了CBM3-Δ10aa-UOX在检测实际血清样品中低浓度UA方面的优势。 

此外，还评估了所开发的CBM3-Δ10aa-UOX生物传感器的重现性和选择性（抗干扰能力）。通过在PBS溶液（pH 8.0）中对0至1.25 mM不同浓度梯度的UA样品进行三次重复测量测试其重现性。生物传感器对UA的响应几乎一致，相对标准偏差（RSD）范围为0.4%至2.5%，证实了其高重现性（图5E和F）。选择性是生物传感器的重要参数，因为常见的共存生理电活性物质（如葡萄糖、抗坏血酸（AA）和多巴胺（Dop））可能会干扰UA的电流响应。随后，探讨了血液样品中常见干扰物的影响。图5G和H显示，标准UA溶液（0.5 mmol/L）与干扰物（抗坏血酸（AA）100 μmol/L、多巴胺（Dop）25 nmol/L、葡萄糖（Glu）10 mmol/L、尿素2 mmol/L）在正常和高生理水平下的电流响应分别为UA电流响应的94.6%、97.4%、96.2%和97.2%，表明这些潜在干扰物对血液样品中UA检测的影响可忽略不计。

 

此外，对所开发的CBM3-Δ10aa-UOX生物传感器的重现性和选择性（抗干扰能力）进行了评估。通过在PBS溶液（pH 8.0）中对不同浓度梯度（0至1.25 mM）的尿酸（UA）样品进行三次重复测量，测试了其重现性。该生物传感器对UA的响应几乎一致，相对标准偏差（RSD）在0.4%至2.5%之间，证实了其高重现性（图5E和F）。选择性是生物传感器的一个重要参数，因为常见的共存生理电活性物质，如葡萄糖、抗坏血酸（AA）和多巴胺（Dop），可能会干扰UA的电流响应。随后，探讨了血液样品中常见干扰物的影响。图5G和H显示了标准UA溶液（0.5 mmol/L）与干扰物（抗坏血酸（AA）100 μmol/L、多巴胺（Dop）25 nmol/L、葡萄糖（Glu）10 mmol/L、尿素2 mmol/L）在正常和高生理水平下的电流响应分别为94.6%、97.4%、96.2%和97.2%，表明这些潜在干扰对血液样品中UA检测的影响可以忽略不计。

此外，在逐日电流检测过程中，观察到所有融合UOX的电流在初始几天内达到最大值，随后逐渐下降。为探究这些电流变化的原因，我们推测UOX聚合物之间的相互作用以及连接肽的断裂可能会影响其固定形式和活性位点的暴露。通过Native-PAGE检测了溶液中野生型UOX和CBM3-Δ10aa-UOX的聚合物形式。结果显示，野生型UOX和CBM3-Δ10aa-UOX的主要形式为二聚体和四聚体（图6A）。因此，二聚体和四聚体CBM3-Δ10aa-UOX被固定在纤维素膜上，如图6B所示，但CBM3以不同方向结合在纤维素上的四聚体（分子1）更可能导致连接肽的断裂，并促进CBM3-Δ10aa-UOX（分子1’）的运动或活性位点暴露，这可能部分解释了观察到的电流增加。此外，二聚体（分子2和3）之间形成四聚体的相互作用力容易导致连接肽的断裂（分子2’和3’），这促进了四聚体观察到的电流增加。我们推测，如果野生型UOX与CBM3-Δ10aa-UOX整合，二聚体野生型UOX和CBM3-Δ10aa-UOX倾向于形成四聚体（分子2’’和3’’），如图6C所示，这可能会减少固定后分子之间的拉力并提高稳定性。我们的电化学检测结果证实了这一假设。在最初的7天内，电流响应曲线几乎相同（图6D）。此外，良好的催化活性一直保持到第34天，线性范围为0至0.875 mmol/L [R2 >0.993, 2.26 × 103 μAmol–1Lcm–2, 0.015 mM (S/N = 3)]（图6E）。这一现象进一步反映了CBM3-Δ10aa-UOX连接肽的稳定性增强，与CBM3-UOX和CBM3-Δ7aa-UOX相比，延长了电流增加过程并提高了工作寿命。

 

将所开发的CBM3-Δ10aa-UOX/纤维素/Pt生物传感器的分析性能与之前报道的电化学酶促UA生物传感器进行了比较（表1）。可以看出，该生物传感器的线性范围和检测限（LOD）与文献中报道的大多数电化学电极相比具有竞争力，足以用于健康和稀释的高尿酸血症血清样品中的UA检测。特别是，通过在室温下频繁分析连续注射的线性范围，对该UA生物传感器的可重复使用性进行了评估，其性能远优于大多数之前报道的在不使用时储存于4°C的生物传感器。

3.6 实际样品分析  

为进一步验证所开发的CBM3-Δ10aa-UOX/纤维素/铂生物传感器在实际样品中检测尿酸（UA）的适用性，采用该生物传感器对血清中的UA进行分析，并与基于酶比色法的生化分析仪的结果进行对比。使用CBM3-Δ10aa-UOX修饰的酶电极验证了人血清中的UA含量。表2显示了通过酶比色法检测六名志愿者（志愿者1-4：女性；志愿者5-6：男性）血清样本的UA浓度，分别为137 ± 2.1、289 ± 3.5、452 ± 4.2、575 ± 5.6、539 ± 4.3和268 ± 3.8 mmol/L，变异系数（CV）≤ 1.53%。相比之下，所开发的UA生物传感器检测血清样本的结果无显著差异（配对T检验，p > 0.05）（表2），且CV更小（≤ 1.42%），这表明所设计的CBM3-Δ10aa-UOX生物传感器具有良好的性能。

 

4. 结论  

本研究通过构建CBM融合UOX作为UA生物传感元件，利用CBM与纤维素之间的强亲和吸附作用控制UOX在纤维素修饰电极上的定向固定，旨在提升UA生物传感器的性能。然而，UOX的多亚基依赖性催化活性及不明确的催化机制为获得稳定的基因融合CBM-UOX带来了巨大挑战。借助结构导向的酶工程策略，使用AlphaFold 2、AlphaFold 3、PROCHECK和分子动力学（MD）模拟等多种计算程序评估了CBM3或CBM2与UOX N端或C端融合的结构稳定性，发现N端CBM3融合优于C端CBM3或CBM2融合，并通过SDS-PAGE分析和电化学检测进一步验证了这一结果。此外，删除了CBM3 N端（P2、V3、S4和G5）和连接肽（K157、E158、P159、M161、S162和N163）中的不稳定残基，构建了CBM3-Δ10aa-UOX，其稳定性通过MD轨迹的结构参数、SDS-PAGE分析和电化学检测进行了表征，结果表明其稳定性显著提升。  

CBM3-Δ10aa-UOX生物传感器在0至0.625 mM UA的线性范围内表现出良好的催化活性，R² > 0.99，可持续使用20天，具有高灵敏度（2.13 × 103 μAmol–1Lcm–2）和低检测限（0.0010 mM，信噪比S/N = 3）。此外，该生物传感器在实际样品检测中表现出优异的重复性、选择性（抗干扰能力）和适用性。通过Native-PAGE分析和野生型UOX与CBM3-Δ10aa-UOX的共固定化，解释了逐日电流检测过程及初始几天电流增加的机制，进一步证明了CBM3-Δ10aa-UOX连接肽的增强稳定性延长了电流增加过程并提高了工作寿命。  

尽管与文献中一些更简单的方案相比，本策略的检测限、检测范围或重复性并非最优，但其具有独特的优势。通过CBM-纤维素相互作用实现UOX的定向固定，为长期操作提供了更稳定的平台，这对于实际应用中可能含有干扰物质的样品至关重要。本固定化策略赋予的稳定性有助于维持传感器的长期性能。计算导向的酶工程方法不仅优化了CBM-UOX融合，还加深了对酶结构与功能关系的理解，为进一步改进提供了潜力。此外，该生物传感器的性能（包括灵敏度和线性范围）足以满足许多实际应用需求，如监测相关患者群体或环境样品中的UA水平。本研究展示了利用计算方法设计多聚体生物传感融合酶的潜力，强调了定向固定在生物传感领域的重要性，并为开发具有增强稳定性和实际适用性的类似生物传感器提供了稳健的策略。

 

 

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