应用案例：iPSC细胞系的培养和定向分化

Generation of four integration-free iPSC lines from related human donors

Anja Patricia Ramme⁎, Daniel Faust, Leopold Koenig, Uwe Marx

TissUse GmbH, Oudenarder Str. 16, 13347 Berlin, Germany

Stem Cell Research 41 (2019) 101615

来自一个高加索家庭的两名男性和两名女性，年龄在 19 至 82 岁之间，献血用于 iPSC 的生成，通过转染表观载体（Epi5 Kit，ThermoFisher A15960）获得，无整合重编程。StemUse105 iPSC品系是从一名白血病患者身上重编程的，其他三个品系都来自健康的捐献者。所有四个品系的明视野图像都显示了细胞紧密排列的集落形态，细胞核与细胞质的比例很高（图 1A-D，I 和 II，比例 100 μm）。所有四个 iPSC 株系的 NANOG、SSEA5 和 OCT3/4 免疫荧光染色均为阳性，α-Actin 为阴性（图 1A-D，III-V，比例尺 100 μm）。流式细胞仪染色显示，超过 95% 的细胞群 TRA-1-60 阳性，SSEA1 阴性；98% 的细胞群 SSEA5 和 TRA-1-60 阳性；92% 的细胞群 TRA-1-60 阳性。

TissUse GmbH

细胞系标识    TISSUi001-A TISSUi002-A TISSUi003-A TISSUi005-A

细胞系库    人类多能干细胞注册中心 (hPSCreg): https://hpscreg.eu/search?q=TISSUi

伦理批准    Ethikkomission der Ärztekammer Berlin; Eth 25/16
 

在所有四个 iPSC 株系中，OCT3/4 和 SOX2 阳性率为 92%，NANOG 阳性率为 92%（图 1E 和补充图 S 3-S6）。基于转录组数据的生物信息学检测 PluriTest™ 进一步证明了所有四个品系的多能性（补充数据图 S 1A）。我们将所有四个 iPSC 株系定向分化成外胚层细胞（神经元细胞）、内胚层细胞和中胚层细胞（心肌细胞）。 
所有四个 iPSC 株系的早期神经元标志物 TUBB3 和神经元干细胞标志物 PAX6 均呈阳性染色（图 1A-D，VI，比例 100 μm）。使用市售试剂盒进行了确定性内胚层分化，结果发现91%以上的细胞为CXCR4阳性细胞，77%以上的细胞为FOXA2阳性细胞（图1E和补充图S 7-S 10）。从肌球蛋白重链（MHC）和心肌肌钙蛋白 T（cTnT）的表达来看，所有四种 iPSC 株系都分化成了跳动的心肌细胞（4% 到 74%，取决于 iPSC 株系）（图 1E 和补充图 S 11-S14）。  
KaryoStat™ 检测由 Life Technologies 公司进行，结果显示所有四个 iPSC 株系都没有染色体畸变（补充数据图 S 1B）。然而，平衡易位不能通过 KaryoStat™ 检测确定。对 15 个短串联重复序列和 X 基因座的分析证明了所有四个 iPSC 株系与相应血液样本的一致性（作者可提供数据）。所有四个 iPSC 品系的支原体（补充数据图 S 15 和 S 16）和细菌污染检测结果均为阴性。表 1-3 总结了品系特征的所有数据。 

今后，所有 StemUse 细胞系都将进一步分化成不同的细胞类型。之后，这些不同类型的细胞将在多器官芯片（TissUse GmbH，德国）中共同培养，以研究器官模型之间的相互作用。我们已经在 StemUse101 系列中展示了这种方法。StemUse101品系的四个不同器官模型--肠、肝、肾和神经元模型--在德国TissUse GmbH公司的四器官芯片（HUMIMIC Chip4）中分化和共培养，并在共同生长因子剥夺培养基中维持长达14天（Ramme等人，2019年）。此外，StemUse101 系还被用于生物反应器系统中的三维神经元分化（Koenig 等人，2018 年）。

1. iPSC 细胞培养

细胞培养板和组件购自美国康宁公司，除非另有说明，否则培养温度为 37 °C、5% CO2。人类 iPSC 细胞系 HUMIMIC StemUse101、StemUse102、StemUse103 和 StemUse105（TissUse GmbH，德国）来源于外周血单核细胞。重编程由服务提供商 Phenocell SAS（法国格拉斯）通过转染表观载体（Epi5 Kit，Thermo Fisher A15960）完成。iPSCs 在 StemMACS iPSBrew XF（Miltenyi Biotec）中无馈源条件下保存，置于经细胞培养处理的平皿上的生长因子还原（GFR）Matrigel®（1:100 稀释于 KO/DMEM F12；Thermo Fisher ）上。每隔五到七天用 Accutase® 对 iPSCs 进行一次传代，将每平方厘米 4,000-6,000 个细胞播种在含有 10 μM 岩石抑制剂（RI）Y-27632（Cayman）的培养基中。每天更换培养基，48 小时后更新不含 RI 的 StemMACS iPS-Brew XF 培养基。

2. 直接分化为最终内胚层

使用 STEMdiff™ DE 试剂盒（TeSR™-E8™ Optimized, STEMCELL Technologies）将所有四种 iPSC 株系分化为最终内胚层（DE），按照制造商的说明稍作修改即可。用 Accutase 将 iPSCs 分割，并以 33,000 cells/cm² 的细胞数种在 GFR Matrigel 上，iPSC 培养基中补充 10 μM RI 和 STEMdiff™ DE TeSR™-E8™ Supplement (1:20)。根据制造商的说明更换培养基。 

3. 直接分化成心肌细胞

所有四个 iPSC 品系都成功分化成了跳动的心肌细胞。StemUse101和StemUse102品系在三维球体内分化，StemUse103和StemUse105品系在单层体内分化。单层分化时，iPSCs 生长至 50%汇合。随后，用 PBS 轻轻清洗细胞，用心脏分化培养基（RPMI 1640，L-谷氨酰胺，辅以 2% B-27™ Supplement（胰岛素除外）、50 μg/ml L- 抗坏血酸 2-磷酸镁盐水合物、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM 2-巯基乙醇和 1% 青霉素-链霉素）取代培养基，并加入 5 μM CHIR-99021（LC 实验室）。48 小时后，将培养基换成含有 5 μM Wnt-C59 （Cayman）的心脏分化培养基。再过 48 小时后，用 PBS 轻轻洗净细胞，然后用含有 2% B-27™ Supplement 的分化培养基代替 B-27™ Supplement。
的分化培养基，而不是含有胰岛素的 B-27™ Supplement。此后每隔两到三天更换一次分化培养基。为了形成三维球状体，将含有 0.35×106 个 iPSCs/mL 的 2 mL 单细胞悬浮液（在含 RI 的 iPSC 培养基中）放入 ULA 六孔板的一个孔中。48 小时后，慢慢将培养基换成 iPSC 培养基，但不提取 iPSC 球形细胞。再过两天，每天更换 iPSC 培养基，如上所述开始心肌细胞分化。心肌细胞的流式细胞术分析在跳动区域可见时进行。因此，不同品系的分析天数不同： StemUse101第8天，StemUse102第10天，StemUse103第15天，StemUse105第9天。

4. 直接分化成神经细胞

根据 Chambers 等人的改良方案，在十天内通过双重 SMAD 抑制将汇合的 iPSCs 分化为早期神经外胚层（Chambers 等人，2009 年）。简而言之，iPSC 生长到几乎汇合为止。将培养基换成神经诱导培养基（KO DMEM、15% KnockOut 血清替代物、2mM L-谷氨酰胺、1% 非必需氨基酸、50 μM 2-巯基乙醇和 1%青霉素-链霉素），辅以 10 μM SB431542（Miltenyi Biotec）和 1 μM LDN193189（Selleckchem），开始分化。每两天更换一次神经诱导培养基，同时不断补充 10 μM SB431542 和 1 μM LDN193189 的神经分化培养基（Neurobasal，2% B-27TM Supplement minus vitamin A，1% N-2 Supplement，2mM L glutamine，1% non-essential amino acids，1% penicillin-streptomycin）（第 4 天 25%，第 6 天-50%，第 8 天-75%）。第 10 天时，通过机械解离将增厚的神经外胚层移出，并在涂有 GFR-Matrigel® 的平板上继续培养 7 天，培养基中添加 50 ng/ mL SHH（Peprotech）、100 ng/mL FGF-8b （Peprotech）和 20 ng/mL BDNF（Peprotech）以富集神经细胞。