应用案例（蛋白稳定性分析仪-PSA-16）：PSA如何测量蛋白的变性和复性

原创发表：北京佰司特科技有限责任公司     

多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16基于内源差示扫描荧光（ifDSF）技术，广泛应用于蛋白质稳定性研究、蛋白质类大分子药物（抗体）优化工程、蛋白质类疾病靶点的药物小分子筛选和结合力测定等领域，具有快速、准确、高通量等诸多优点。蛋白质中色氨酸/酪氨酸的荧光性质与它们所处的环境息息相关，因此可以通过检测蛋白内部色氨酸/酪氨酸在加热或者添加变性剂过程中的荧光变化，测定蛋白质的化学和热稳定性。

PSA-16采用紫外双波长检测技术，可精准测定蛋白质去折叠过程中色氨酸和酪氨酸荧光的变化，获得蛋白的Tm值和Cm值等数据；测定时无需额外添加染料，不受缓冲液条件的限制且测试的蛋白质样品浓度范围非常广（10 µg/ml - 250 mg/ml），因此可广泛用于去垢剂环境中的膜蛋白和高浓度抗体制剂的稳定性研究。此外，PSA-16具有非常高的数据采集速度，从而可提供超高分辨率的数据。同时PSA-16一次最多可同时测定16个样品，通量高；每个样品仅需要15 uL，样品用量少，非常适合进行高通量筛选。PSA-16操作简单，使用后无需清洗，几乎无维护成本。

通过温度循环实验，即等温循环实验或者增温循环实验，可以研究蛋白变性和复性。样品管进行封闭后，可保证蛋白溶液不会挥发，完成长达数十小时的持续检测。具体步骤如下：

Part 01. 实验步骤

1） 在进行等温循环实验时，首先设置样品的保持温度。保持温度可设置的范围为15-110℃，可通过“+”“-”按钮进行调整，步进值为1℃。

2） 接下来是设置样品在起始温度下的保持时间。保持时间可以在1-60 min之内设置。保持时间可通过“+”“-”按钮进行调整，步进值为1 min。

3） 设置样品的终点温度。终点温度可设置的范围为15-110℃，可通过“+”“-”按钮进行调整，步进值为1℃。

等温循环设置

3） 然后设置每个循环的增温幅度。可通过“+”“-”按钮进行调整，步进值为1℃。

增温循环设置

4） 接下来是设置样品在终点温度下的保持时间。保持时间可以在1-60 min之内设置。保持时间可通过“+”“-”按钮进行调整，步进值为1 min。

5） 最后设置循环次数，循环次数最大值为50。

6） 可以根据样品浓度的不同，选择检测灵敏度。高检测灵敏度适合0.05-1 mg/ml的样品，中检测灵敏度适合1-10 mg/ml的样品，低检测灵敏度适合10 mg/ml以上的样品。

7） 可根据具体实验时长的不同，选择数据采样的时间间隔。推荐在60 min之内的实验，扫描间隔可以选择3 S收集一次数据。60 min以上的实验，扫描间隔可以选择30 S或60 S收集一次数据。

8） 参数设置完成后，即可点击“预扫描”按钮。仪器会对样品进行扫描，检查荧光值是否符合实验要求。

注释：330 nm和350 nm的荧光值需要在5000-60000之间。在此范围之内荧光值数字会显示为绿色，表示通过。在此范围之外荧光值数字会显示为红色，表示不通过。如果荧光值过低或者过高，可首先通过调整检测灵敏度，再次进行预扫描来获得合适的荧光信号。如果无法通过调整检测灵敏度获得合适的荧光信号，则需要对样品进行稀释或者浓缩。

9） 在预扫描通过后，即可点击“开始实验”按钮进行热稳定性测试。

Part 02. 实验结果

10） 试验完成后，软件会自动进行数据分析并进入结果查看界面。

11） 可以通过350/330荧光值比值的变化趋势，来判断蛋白在温度循环中的变性和复性情况。

Part 03. 总结讨论

多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16应用涵盖植物、生物学、动物科学、动物医学、微生物学、工业发酵、环境科学、农业基础、蛋白质工程等多学科领域。蛋白质是最终决定功能的生物分子，其参与和影响着整个生命活动过程。现代分子生物学、环境科学、动医动科、农业基础等多种学科研究的很多方向都涉及蛋白质功能研究，以及其下游的各种生物物理、生物化学方法分析，提供稳定的蛋白质样品是所有蛋白质研究的先决条件。因此多功能蛋白质稳定性分析系统在各学科的研究中都有基础性意义。

1.    抗体或疫苗制剂、酶制剂的高通量筛选

2.    抗体或疫苗、酶制剂的化学稳定性、长期稳定性评估、等温稳定性研究等

3.    生物仿制药相似性研究（Biosimilar Evaluation）

4.    抗体偶联药物（ADC）研究

5.    多结构域去折叠特性研究

6.    物理和化学条件强制降解研究

7.    蛋白质变复性研究（复性能力、复性动力学等）

8.    膜蛋白去垢剂筛选，膜蛋白结合配体筛选（Thermal Shift Assay）

9.    基于靶标的高通量小分子药物筛选（Thermal Shift Assay）

10.    蛋白纯化条件快速优化等

北京佰司特科技有限责任公司 (https://www.best-sciences.com)

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