应用案例：基于微流控芯片的肝-肾类器官串联共培养进行药物测试

应用案例（类器官培养仪-HUMIMIC）：基于微流控芯片的肝-肾类器官串联共培养进行药物测试

Repeated dose multi-drug testing using a microfluidic chip-based coculture of human liver and kidney proximal tubules equivalents

翻译整理：北京佰司特科技有限责任公司

  多器官微流控串联芯片可模拟组织类器官培养的微环境，实现类器官之间的串联培养并减少物种间的差异，所以该技术成为一种前景广阔的临床前药物筛选的强大工具。中国食品药品检定研究院，安全评价研究所（国家药物安全评价监测中心），首都医科大学基础医学院、北京市药品检验研究院、德国柏林工业大学联合德国TissUse GmbH公司的科学家一起合作，建立了一个基于微流控芯片的类器官模型，可以串联肝脏和肾脏类器官，共同培养16天。同时，对单独给药环孢素A（CsA））或联合利福平给药，进行了为期14天的重复剂量的全身给药。比较两种不同剂量的CsA对不同靶器官的毒性特征，与连续14天使用csA治疗相比，从第6天开始联合利福平用药会降低CsA浓度并减轻毒性。肝脏和肾脏类器官在类器官芯片上的串联共培养，显示了其作为药物开发临床前阶段重复剂量多种药物毒性筛选的有效转化工具的潜力。

药物引起的肾毒性和肝毒性与严重的发病率和死亡率有关。肾脏在维持电解质平衡以及处理过滤、分泌和重吸收方面发挥着关键作用。肾近曲小管通过主动运输（重吸收或分泌）清除外源性物质，这得益于表达功能性转运蛋白的近端小管上皮细胞的强极化。肝脏控制着外源性物质的代谢，而肾脏则负责将其排出体外。外源性物质的血浆浓度和生物利用度会通过肝脏的毒性/解毒作用发生改变，从而导致肾脏毒性的改变。因此。肾近曲小管和肝脏是毒性化合物的主要靶点。目前用于证明药物肾毒性和肝毒性的临床前模型包括体外和体内模型。然而，动物模型由于培育时间长和动物伦理问题存在局限性，在静态条件下的传统细胞培养方法无法模拟类似体内的微环境。

为了支持ToxCast/Tox21计划，需要发掘更多的高通量毒性评估预测方法。人体器官芯片技术的发展克服了当前临床前模型的缺陷，并支持3R原则（即替代、减少和优化动物使用）。目前的类器官串联芯片集成了微流泵和类器官培养部分，使得液体与组织的比例与人体中的相似。肝-肾串联芯片满足体系中营养物、化合物及类器官代谢物的分布和交换，因此两种类器官之间的交流通讯得以保证。

 

图1、微流控肝肾二器官串联芯片。（A）装置的放大图，包括容纳两个微流道的PDMS芯片。（B）红色粗体箭头表示微流道内的液体流动方向，以及在MOC中共同培养肝脏、肾脏类器官的实验设置。（C）16天共培养的示意图，包括2天的适应期和14天的重复给药，每天交换培养基，第1、7和14天收集上清，第0和14天收集细胞样本。

平衡稳态确保可以观察到肝脏和/或肾脏损伤的不同阶段。此外，人类肾近端小管细胞可以形成一个完整的屏障，并表达对药物诱导的肾损伤和药物相互作用至关重要的功能性酶和转运蛋白。共培养的肝脏类器官表达了肝特异性标记、人类酶和转运蛋白，其水平与2D细胞培养相当甚至更高，并至少维持了28天。

环孢素A（CsA）是一种具有肾、肝毒性作用的免疫抑制剂，被用作模型药物来刺激基于芯片的肝肾共培养系统。为了进一步评估二联器官芯片（2-OC）上的药物代谢和毒性，我们使用了CsA和利福平（RFP，一种肝酶和转运体诱导剂）的联合给药。关于CsA的药理学、药代动力学和毒性的研究结果表明，不同物种之间存在很大差异，尤其是在代谢特征方面。因此，根据临床试验中使用的剂量，将两种不同的CsA剂量（无毒/有毒剂量）和RFP治疗剂量应用于二连器官串联芯片。

据我们所知，这是首次有研究表明基于微流控芯片的肝-肾类器官串联共培养模型可用于连续14天重复单独或联合给药的毒性研究。肝-肾类器官芯片可有效模拟药物在人体内的相互作用过程及其对毒性的影响。研究结果表明，肝-肾类器官串联共培养芯片有望结合形态学、组织病理学、分子生物学、药物代谢和无创毒性生物标志物的检测，阐明药物相互作用、代谢和毒性。

 

结果

我们设计了一个可容纳两个相同微流路的二联器官芯片，每个回路将肾近端小管屏障与脏类器官串联，用于后续的共培养。（图1 A / B ）。

肾近曲小管屏障的特征、完整性和功能：RPTEC/TERT1细胞在transwell上贴壁培养，分化并形成了完整的单细胞层（图2A）。免疫荧光染色结果表明RPTEC/TERT1细胞清晰地显示了泛上皮标记物CK8/18（图2B，C）。通过对乙酰化微管蛋白的染色观察到了初级纤毛的形成（图2D）。图2E和图2F分别显示了MRP-2和Na+-K+-ATPase的定位，这些是功能性极化单层RPTEC的指标。ZO-1（图2G）和Claudin-10（图2H）在细胞边界的表达证实了邻近RPTEC/TERT1细胞之间形成了紧密连接，并表明了适当的细胞极化以及屏障的完整性。Ki67的阳性染色（图2I）显示了增殖的细胞。

在图2J-L中展示了在2-OCs中16天培养期间，功能性转运蛋白MRP-2、P-gp和Ki67的RT-qPCR分析结果，用作基因表达变化的对照。

 

图2、肾近端小管屏障的特征。 （A） Transwell上形成肾近端小管单层细胞。 （B） CK8/18（绿色） （C） CK8/18（绿色），横截面 （D） 乙酰化微管蛋白（绿色） （E） MRP-2（红色） （F） 钠钾ATP酶（红色） （G） ZO-1（红色） （H） Claudin-10（红色） （I） Ki67（红色）。 细胞核用DAPI（蓝色）染色。 比例尺：B、D和E：100μm；C、F、G、H和I：50μm。 对（J） MRP-2 （K） P-gp （L） Ki67的基因表达进行qRT-PCR分析。数据为平均值 ± 标准误差，实验进行了三次重复。

肝的特征和功能：HepaRG细胞的形态和分化、肝球的形成、免疫荧光染色以及肝脏功能酶和转运体的RT-PCR分析见附录。图1.结果表明，微流控多器官串联芯片中的肝球体具有长期维持和可重复分化的特点，细胞增殖、分化和凋亡之间达到了平衡，从而实现了肝球体的生理平衡。

二器官串联芯片培养16天的表现：肾脏类器官（代表排泄系统）和微流道通路（代替血液循环）中的LDH水平的检测结果表明（图3A）二器官芯片中的排泄系统和血液循环中的LDH产生水平保持稳定，这表明在整个16天的共培养过程中，不同培养腔内的细胞发生了人为但稳定的生理更替。

在16天的共培养期间，两种培养基中的葡萄糖水平测量结果总结在图3B中。微流道通路和培养腔的葡萄糖浓度严格维持在2.5 mM至6mM之间，以确保为二联器官芯片提供足够的能量。近端小管腔内的葡萄糖水平比初始培养基中的17.5 mM降低了大约三倍。微流道循环中的葡萄糖浓度持续下降到初始11.1 mM的50%，这在正常血糖的范围内。这些发现表明，在16天的肝-肾串联共培养期间，二联器官芯片建立了一个非常稳定的葡萄糖平衡。

 

图3、16天内肝肾类器官共培养系统的表现。（A）2-OC系统中的系统组织活力由微流道通路（红色）和近端小管腔（黄色）乳酸脱氢酶（LDH）产量表示。（B）2-OC中的流道通路（红色）和近端小管腔内（黄色）的葡萄糖浓度平衡。虚线代表每天加入肝脏部位（红色）和近端小管腔内（黄色）的培养基的初始葡萄糖浓度。（C）通过测量循环培养基中的乳酸产量和葡萄糖消耗来衡量共培养的代谢活性。

我们利用微流道通路中的葡萄糖消耗量和乳酸生成量，作为评价共培养系统代谢活动的指标（图3C）。2-OC系统的新陈代谢活动呈现双相曲线，在前两天未给药的情况下，新陈代谢活动持续下降，而从第零天开始，新陈代谢活动进入稳定状态，略有波动。微流道通路中乳酸生成量的轻微下降可能表明肝球和近端小管屏障之间存在条件效应。

细胞活力和代谢曲线都证明，2-OC系统可以同时、连续培养肝、肾类器官16天，同时保持其活力和特征功能。以重复性高，稳定性强的方式建立微流控连接的串联共培养系统有利于在后续实验中应用这些物质。

基于芯片的肝-肾类器官串联培养系统十四天重复剂量药物暴露模型：用CsA或CsA结合RFP处理基于芯片的肝-肾串联共培养模型，以观察在不同程度的毒性威胁下器官之间的相互作用。在给药第一天（第1天）和最后一天（第14天）以及联合给药第一天（第7天）之后的24小时，取样检测肝类器官代谢后的CsA（图4A）或RFP（图4B）浓度。如图4C所示，在第1天、第7天和第14天给药后24小时，随着剂量水平从5uM增加到20 uM肝类器官在微流道通路的CsA暴露增加。连续给药七天后24小时的CsA水平低于第一次和最后一次给药后的水平。在第一次和最后一次联合给药后，当20 uMCsA与25uM RFP全身联合给药时，微流道通路中的CsA浓度下降。同时给药RFP8天后，有RFP或无RFP循环之间CsA浓度的降低有所减弱。同时，每天联合给药8天后，RFP的浓度增加（图4D），表明RFP在微流道通路积累。为了评估毒性物质对肝、肾类器官的影响，我们检查了乳酸脱氢酶（LDH）的释放。LDH作为评估体外肾毒性的可靠生物标志物，我们在两种培养基中进行了测定。在第1天、第7天和第14天，随着环孢素A（CsA）浓度的增加，微流道通路中的LDH浓度逐渐增加（图 5A）。连续8天联合给药25uM RFP后，全身给药20uM CsA的血路中LDH水平下降，这与微流道通路中的CsA浓度一致。然而，首次联合给药后未观察到这种下降（图5A）。在实验终点，联合给药组的p53基因表达比未处理的对照组增加了1.5倍，而Ki67的表达没有变化（图5B，C）。然而，排泄腔中的LDH释放量显示出急剧但不显著的增加（图5H）。首次联合给药后，与未处理的对照组相比，第7天的IDH水平继续升高（图5H）。然而，在同时使用RFP8天后，可以观察到LDH水平急剧下降（图5H）。此外，与对照细胞相比，用高剂量CsA处理14天的肾类器官中p53基因的表达量增加了2.3倍（图5I，J）。同时用CsA和RFP处理的肾类器官中，Ki67基因的表达量增加了2.7倍，而在实验终点，低剂量组和高剂量组的Ki67表达量都显著下降（图5I，J）。如图5D-G所示，TUNEL/Ki67/DAPT三重染色显示CsA暴露增加了细胞死亡，而在CsA与RFP联用的肝海绵体中可以观察到细胞死亡的缓解。通过 Ki67阳性染色观察到的增殖细胞均匀地分布在肝球中，并保持在芯片中，不同处理组之间没有显著变化（图5D-G）。

常规和新型非侵入性毒性生物标志物的蛋白质表达：为了探索MOC平台在早期检测和诊断器官特异性毒性方面的进一步应用，我们检测了已被批准用于临床实践的常规和新型生物标志物，以确定本实验中的药物诱导的肝脏和肾脏损伤。生物标志物水平变化的观察结果列于补充表3中。

 

图4、每日给药或联合给药后CsA和RFP的浓度测定以及2-OC中肝-肾类器官的代谢。（A）循环介质中CsA的质谱。箭头表示CsA的特征峰。（B）循环培养基中RFP的质谱。箭头表示RFP的特征峰。（C）每天重复给药，联合给药后循环介质中CsA的浓度，以及第1、7和14天在2-OC中肝-肾类器官的代谢情况。（D）每天重复联合给药后循环介质中RFP的浓度，以及第7和14天在2-OC中肝-肾类器官的代谢情况。实验分别在对照组和低剂量组进行了三次重复，而在高剂量组和联合给药组进行了四次重复。* （#） 或 **（##） 分别表示 p 值小于0.05 或0.01 的显著性差异。* 或 # 分别表示与相应对照组或联合给药组与高剂量组比较的差异。

微流道通路中的生物标志物（图6），肝酶AST呈剂量依赖性升高，联合用药组的AST水平在终点而非RFP首次用药后出现下降。ALP在CsA治疗后升高，仅在第14天有显著变化，而在20uM CsA给药时，同时使用RFP会降低ALP水平。只有在RFP后阶段才能观察到TBiI的显著增加。微流道通路中葡萄糖的下降呈剂量依赖性，这些分子在第7天的高剂量组和第14天的两个治疗组中都达到了有统计学意义的水平。同时使用20 uM CsA和RFP治疗后，在联合给药阶段，代用血回路中的葡萄糖浓度升高。代用血中的肾毒性生物标志物CRE和UREA在第1天有所增加，但在第7天和第14天未观察到与药物有关的变化。AB、GGT和Lac的水平未发现与CsA相关的变化。

在排泄系统中的生物标志物：在排泄介质中（见图7），GGT（γ-谷氨酰转移酶）水平在第一天显示出剂量依赖性增加。然而，在连续七次CsA治疗后，高剂量组的GGT水平明显下降，第14天也观察到了类似的效果。与RFP的同时治疗在第7天和第14天并未导致GGT水平降低。所有治疗组的近端小管屏障部分也是如此。

 

图5、在肝-肾类器官串联芯片中每日单独或同时使用CsA14天的毒性概况。（A）第1、7和14天代用血液培养基中的LDH活性。qRT-PCR分析实验终点时肝脏球体内（B）p53（C）Ki6基因的表达。实验结束时，（D）对照组、（E）低剂量组、（F）高剂量组和（G）联合用药组肝球形细胞的TUNEL/Ki67（绿色/红色）染色。（H）第1、7和14天排泄介质中的LDH活性。实验终点时，近端小管屏障中（I） p53和（J）Ki67基因表达的qRT-PCR分析。数据为平均值主±标准差，实验分别在对照组和低剂量组进行了三次重复，而在高剂量组和联合给药组进行了四次重复。* （#） 或 ** （##） 分别表示 p 值小于 0.05 或 0.01 的显著性差异。* 或 # 分别表示与相应对照组或联合给药组与高剂量组比较的差异。 

随着CsA剂量的增加，尿液中的NAG酶也会分泌。CsA和RFP对排泄池中ALP的影响相似。在CsA作用下，葡萄糖呈剂量依赖性下降，联合用药组的葡萄糖水平低于CsA治疗组。CsA治疗后Lac浓度明显升高，而RFP减轻了CsA对Lac分泌的影响。

 

图6、在肝-肾串联培养芯片中每天单独或同时使用CsA 14天后，微流道通路中无创毒性生物标志物的蛋白质表达。蛋白水平（A）AST（B）ALP（C） TBiL（D）Glucose（E） CRE（F）UREA（G）AIB（H）CGT（I）第1、7和14天循环介质中的乳酸盐。数据为平均值主±标准差，实验分别在对照组和低剂量组进行了三次重复，而在高剂量组和联合给药组进行了四次重复。* （#） 或 ** （##） 分别表示 p 值小于 0.05 或 0.01 的显著性差异。* 或 # 分别表示与相应对照组或联合给药组与高剂量组比较的差异。
    KIM-1是肾脏特异性生物标志物，已通过监管机构的正式鉴定，在整个研究期间呈剂量依赖性升高，CsA介导的KM-1升高随时间推移而减弱，同时服用RFP时也是如此。排泄介质中的CysC和ColIⅣ水平也出现了类似的结果。但在RFP后阶段，RFP会增强ColIⅣ的作用。CsA治疗后，Clu和NGAL的浓度明显升高，而RFP明显降低了Clu和NGAL的水平。此外，在研究的中期阶段，这两种生物标志物的分泌水平达到了最高水平，使用RFP后的降低幅度也最大。在实验期间，OA的分泌水平是持续的，高剂量组的OA水平维持在较高水平。联合给药组的OA降低呈延迟显著性。同样，用20uM CsA处理后，IP-10有所增加，而RFP则在第14天使IP-10略有下降。CsA诱导的GST-a和白蛋白水平的剂量依赖性增加仅在第1天才能观察到。CsA增强了FABP-1，而同时使用RFP产生的降低直到后期（第14天）才被观察到，而REN和a1-MG在第7天和第14天发生了类似的药物诱导变化。在第1天，CsA可引起OPN的增加，但与剂量无关，而在第7天，OPN的增加与剂量有关。虽然CsA对OPN的影响在第14天消失了，但RFP诱导的OPN明显降低在RFP后阶段得以保持。TIMP-1在第1天显示出剂量依赖性的显著增加。然而，CsA对TIMP-1的影响在第7天和第14天逆转。在RFP后阶段，CsA对TIMP-1水平的增加有不同程度的减弱。使用CsA或同时使用RFP治疗后，EGF会出现剂量依赖性下降。在CAIB和TFF-3中未观察到与药物相关的变化（数据未显示）。

图7、在肝-肾串联培养芯片中每天单独或同时使用CsA 14天后，排泄腔中非侵入性毒性生物标志物的蛋白质表达。（A）CGT （B） ALP（C）NAG（D）葡萄糖（E）乳酸盐（F）KIM-1（G）胱抑素C的蛋白质水平（H）胶原Ⅳ（I）凝集素（J）NGAL （K）骨活素（L）IP-10（M）GST-a（N）白蛋白（O）FABP-1（P）肾素（Q）α1-微球蛋白（R）骨素（S）TIMP-1（T）第1天、第7天和第8天排泄培养基中的表皮生长因子14。数据为平均值±SEM，实验分别在对照组和低剂量组进行了三次重复，而在高剂量组和联合给药组进行了四次重复。* （#） 或 ** （##） 分别表示 p 值小于 0.05 或 0.01 的显著性差异。* 或 # 分别表示与相应对照组或联合给药组与高剂量组比较的差异。

代谢酶和转运体基因表达的变化：在本研究中，我们进一步研究了在两个类器官中表达的功能酶和转运体及其在解毒或毒化过程中的作用（图8）。实验结束时，同时使用RFP会显著诱导肝脏、肾脏类器官中MRP-2的表达。与RFP同时给药后，肝球体中Pgp基因的表达略有增加。相比之下，RPTEC/TERT1细胞中的P-gp基因表达可以通过连续使用环孢素A （CsA） 显著诱导，而在联合给药组中，P-gp基因的诱导则无法观察到。

 

图8、在肝-肾串联共培养芯片中每天单独或同时使用RFP 14天后，代谢酶和转运体在肝球和近端小管屏障中的基因表达。实验结束时，肝脏（A）MRP-2（C） Pgp （E）CYP3A4 （F）BSEP和肾内（B）MRP-2（D）P-gp的mRNA表达量与对照组相比的折叠变化。数据为平均值± 标准差，实验分别在对照组和低剂量组进行了三次重复，而在高剂量组和联合给药组进行了四次重复。* （#） 或 ** （##） 分别表示 p 值小于 0.05 或 0.01 的显著性差异。* 或 # 分别表示与相应对照组或联合给药组与高剂量组比较的差异。

在CsA处理组中，观察到CYP3A4和BSEP的表达有统计学意义和剂量依赖性的下降。CsA对BSEP的抑制作用因同时给予RHP而略有减弱，而CsA组和同时治疗组之间的CYP3A4则无明显差异。

 

讨论

最新研究表明，类器官芯片技术可重建三维（3D）微环境，模拟人体器官和组织的结构、力学、生理和代谢特性。例如，利用三维技术建立的肝类器官模型显示出增强的肝功能，特别是当非实质细胞被整合进类器官时。我们已经开发出了聚集稳定且重复的肝类器官分化方案，其中包括分化的HepaRG（实质）和HHSteC（非实质）细胞，并能够再现肝小叶结构，即肝脏的功能单位。HepaRG细胞系被用作体外模型来预测药物对人体细胞色素P450 （P450）酶的诱导作用。此外，模拟围绕肝类器官的流体剪切应力和间质压力有助于在芯片中长时间维持基于蛋白质和氧梯度的稳定微环境。而且，包括ZO-1和Claudin-10在内的相关蛋白的表达，表明在整个共培养过程中，近曲小管细胞屏障的紧密连接组装和细胞极性得到了保持。

长期以来，血清中的肌酐（CRE）和尿素（UREA）的测量已被用于诊断CsA引起的肾毒性；然而，如本研究所观察到的，这些生物标志物在长时间内不显示分泌，因此不敏感且不足。人类RPTEC/TERT1细胞系被证明能够极化形成紧密的单层，并表达特定组织的酶和转运蛋白较长时间，因此已被建立为药物安全评估的体外模型。现有的基于芯片的肝脏-近曲小管共培养模型复制了两个器官和室间的长期生理和分子通信。芯片中共培养的近曲小管屏障等价物表达了若干生物标志物，如KIM-1、CLU、OA和NGAL，用于长时间的毒性评估，模拟体内对肾毒性暴露的反应。FDA和EMEA已批准了八种非侵入性肾损伤生物标志物，这些标志物在体内已被充分描述，并且能在动物或人类的尿液或血液中检测到。在这八种合格的生物标志物中，KIM-1、白蛋白、Clu和TFF-3被认为是与急性肾小管变性相关的标志物。

与先前研究一致，对急性CsA诱导的肾毒性有反应的其余标记物，包括排泄介质中的GST-α、NGAL、OPN、GGT、NAG和TIMP-1，以及代用血中的CRE和UREA，可以被分类为肾小管功能损伤的生物标志物。研究显示，与急性肾小管上皮损伤（包括CsA引起的损伤和体内小管间质纤维化）相关的OA上调。OA的剂量依赖性增加支持了将OA分类为早期近曲小管损伤的敏感生物标志物的结论。主要在肝脏产生的尿液α1-MG在小管和肾小球损伤时都可能升高。肝特异性的FABP（即FABP-1）在近曲小管中表达。这些分子都是急性和尤其是慢性肾小管损伤的生物标志物，因此，这些发现可以部分解释治疗晚期才观察到的FABP-1和α1-MG水平升高。整个研究期间，高剂量CsA上调了Col IV。此外，Col IV在肾小管基底膜中表达；因此，共给药组中Col IV的上调表明了在第14天Ki67基因表达诱导下的肾上皮细胞再生。CALB存在于小肠中，在长期使用CsA后会在远端肾小管中受到抑制。因此，CALB作为体外和体内肾小管损伤的生物标志物对CsA的单次和重复治疗的反应与药物无关。这是首次报告在微流控MOC平台上评估一系列合格和潜在的非侵入性肾毒性生物标志物，展示了MOC在早期药物开发中进行高通量筛选的能力和优势。
        肠道屏障和肾小球等价物将被整合到新型的MOC系统中，例如四器官芯片，以改进和优化我们的研究。一方面，需要考虑CsA的低生物利用度。CsA的低生物利用度主要是由于肝脏代谢，部分原因是肠道吸收。生物利用度的降低很可能可以通过肠道CYP450酶的诱导来解释，这种诱导显著大于肝脏代谢的诱导。CsA对体内肠肝循环的影响将在MOC平台上得以模拟。
结论
        本研究评估的微流控多器官芯片平台使得可以在16天内，通过连接的培养基回路，非接触共培养可重复且定义明确的肝球体和肾近曲小管屏障，每种结构比其人体对应器官小100,000倍。此外，微流控设备和2-OC模型中设计的流体与组织比率支持充分的器官间通讯。最后，共培养的组织等价物表达了组织特异性的标志物、酶和转运蛋白，并且可以通过具有肝毒性和肾毒性的CsA进行挑战，这些毒性可以通过肝脏药物代谢诱导剂RFP得到缓解。目前基于微流控芯片的平台适合标准化的微组织大小和组织培养格式，可广泛应用于药物筛选，并且越来越多地被监管机构接受。

 

材料和方法

设计和制造二联器官芯片：商业可用的微生理二联器官芯片2-OC由两个96孔细胞培养插件集成。2-OC的制造由TissUse GmbH按照Wagner等人的描述进行。电路中的流体流动是由根据Wu等人的修改，在芯片上的脉冲式微型泵建立的。芯片上的微型泵通过由TissUse GmbH提供的外部控制单元的压缩空气来驱动。

人类细胞来源：人类HepaRG细胞系和人类近曲小管细胞系RPTEC/TERT1（CRL-4031）均从ATCC（位于美国弗吉尼亚州曼纳萨斯的ATCC）购买。HHSteC细胞系是从ScienCell研究实验室（位于美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的ScienCell）购买的。

肝脏类器官培养：HepaRG细胞在HepaRG培养基中培养（含William’s medium E，补充10%胎牛血清（FBS, Life Technologies; 澳大利亚新南威尔士州悉尼），2 mM GlutaMAX，10000 U/ml青霉素，10000 μg/ml链霉素，5 µg/ml人胰岛素（Sigma-Aldrich, 美国圣路易斯）和5×10–5 M氢化可的松半琥珀酸盐（中国北京的国家食品药品监督管理局）。细胞培养基及其补充剂均从Life Technologies（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）购买。HepaRG细胞培养在37°C和5% CO2条件下，每隔一天更换一次培养基。通过在HepaRG培养基中培养细胞两周以诱导HepaRG细胞分化，达到完全贴壁生长。然后添加含2%二甲基亚砜（DMSO; Sigma-Aldrich; 美国密苏里州圣路易斯）的分化培养基再培养两周。HHSteC细胞在从ScienCell研究实验室（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的ScienCell）购买的星形细胞培养基中扩展。细胞在贴壁生长达到80%时收获用于进一步共培养。

人类肝球体的形成按照Wagner等人之前的描述进行。简单地说，每个384孔球体板孔中放置50μl含0.1×104HHSteC细胞和2.4×104 HepaRG细胞的细胞悬液（Corning Costar, 美国肯纳邦克）。细胞在CO2孵化器中的摇床上培养3天，形成圆形且紧凑的球体。然后将球体转移到超低附着力24孔板（Corning Costar, 美国肯纳邦克）。收集40个球体形成一个2-OC系统的单一肝等价物。在EVOS XL Core数字倒置显微镜（Life Technologies, 美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）下评估分化的HepaRG细胞的形态和肝球体的形成。

肾近曲小管屏障模型建立：RPTEC/TERT1细胞在添加了2 mM GlutaMAX、10,000 U/ml青霉素、10,000 μg/ml链霉素、36 ng/ml氢化可的松、5 μg/ml人胰岛素、5 μg/ml转铁蛋白、5 ng/ml硒酸钠（ITS 1×）、10 ng/ml人表皮生长因子（hEGF）的DMEM和Ham’s F-12 （DMEM/F12）培养基中培养。培养基和补充剂均从Life Technologies（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的Life Technologies）购买。氢化可的松从Sigma-Aldrich（美国圣路易斯的Sigma-Aldrich）购买。
        每个Transwell可渗透支架种植100,000个RPTEC/TERT1细胞，并允许它们在夜间附着。然后，更换上室的培养基以移除未附着的细胞。在实验前，种植的支架在2-OC中静态培养4天，灌流条件下培养3天。在2-OC内，将插入膜定位在培养室底部上方100 μm的位置，以确保介质在近曲小管屏障下自由通过。使用EVOS XL Core数字倒置显微镜（Life Technologies, 美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的Life Technologies）监测RPTEC/TERT1的细胞形态和分化。

基于芯片的共培养：实验使用十四个2-OC系统，共培养在500微升循环培养基中，屏障插件顶部添加100微升培养基。排泄池中的培养基每天更换。循环上清的一半被替换并收集。在16天共培养结束时，通过免疫荧光和qRT-PCR分析肝脏或近曲小管等价物的器官特异性功能标志物。芯片上的微泵设置频率为0.8 Hz，从而产生的流速不超过9微升/分钟。

实验试剂：CsA（CAS号：59865-13-3）被添加到重复剂量的共培养中进行测试。RFP（CAS号：13292-46-1）与CsA同时给药。对于储备液，CsA和RFP（中国国家食品药品监督管理局-北京）溶解在DMSO中，在4°C暗处储存，使用时稀释到最终浓度0.1%的DMSO。

药物暴露于肝脏-肾脏共培养芯片：在三天无药物适应性共培养后，CsA储备液被稀释至相应浓度的新鲜培养基中，10 µM（低剂量）和20 µM（高剂量），并每日给药13天。在联合给药组中，每天给予20 µM CsA，直到第6天，然后从第6天到第13天每天同时给予20 µM CsA和25 µM RFP。含0.1% DMSO的培养基用于对照培养（见图1C）。

共培养分析：上清样本：细胞活力通过每日测量肝脏和近曲小管屏障隔室中的上清液的乳酸脱氢酶（LDH）活性来监测。代谢活性通过使用乳酸比色测定试剂盒（Biovision, 美国加州米尔皮塔斯）根据生产商的说明书，每日测量两个隔室上清液中的葡萄糖和乳酸水平来检测。在第1天、第7天和第14天，使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析代用血循环中CsA和RFP的浓度，并检测两个隔室上清液中的毒性生物标志物。包括LDH、葡萄糖、天冬氨酸转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰转肽酶（GGT）、N-乙酰-β-D-葡萄糖胺苷酶（NAG）、总胆红素（TBiL）、白蛋白（ALB, 血清）、肌酐（CRE）和尿素（UREA）的生物标志物的检测，使用日立7180自动生化分析仪（日本）进行。上述标记的试剂盒从Wako（日本）购买。骨活素（OA）、谷胱甘肽-S-转移酶α（GST-α）、KIM-1、脂肪酸结合蛋白-1（FABP-1）、IV型胶原（Col IV）、中性粒细胞明胶酶相关脂钙蛋白（NGAL）、集落素（Clu）、胱抑素C（Cys C）、肾素（REN）、α1-微球蛋白（α1-MG）、骨桥蛋白（OPN）、中性粒细胞明胶酶相关脂钙蛋白（NGAL）、钙结合蛋白（CALB）、金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）、干扰素诱导蛋白-10（IP-10）、三叶因子-3（TFF-3）、表皮生长因子（EGF）和尿白蛋白的测定使用的是Merck Millipore（美国马萨诸塞州比勒瑞卡）的MILLIPLEX MAP人类肾损伤磁珠板1和2。根据生产商的指导，这些检测在美国德州奥斯汀的Luminex 200上执行。数据通过MILLIPLEX Analyst 5.1软件（美国马萨诸塞州比勒瑞卡）分析。

给药前后进行组织培养分析：含RPTEC/TERT1细胞的肝球体和膜被冷冻在O.C.T.化合物中，并储存在-80°C直至进一步分析。为了染色，切片先用-20°C的丙酮固定10分钟或4%的PFA固定10分钟。然后，细胞用0.05%的Triton X-100渗透处理，清洗并用10%的山羊血清封闭30分钟，随后用针对CYP3A4、BSEP、CK8/18、MRP-2、Na+-K+-ATP酶、P-gp、VIM、ZO-1、CLDN 10 和Ki67（所有来自Abcam，美国马萨诸塞州剑桥）的一抗在4°C过夜或常温下孵育2小时，或使用乙酰化微管蛋白（来自Sigma-Aldrich, 美国密苏里州圣路易斯）孵育。之后，切片清洗三次，继续与荧光标记的二抗在常温下孵育1小时。核用DAPI（Sigma-Aldrich, 美国密苏里州圣路易斯）进行染色。
        增殖和凋亡通过TUNEL/Ki67的免疫荧光染色进行分析。简而言之，切片使用TUNEL技术（ApopTag1 过氧化物酶原位凋亡检测套装，Merck Millipore, 德国达姆施塔特）按照生产商的指导进行染色。核用DAPI进行对染。所有的免疫荧光图像均使用尼康Eclipse 80i数字荧光显微镜（日本东京）和奥林巴斯IX 71倒置显微镜（日本东京）配合Image-Pro Plus软件（版本6.0, Media Cybernetics Inc., 美国马里兰）获取。
         肝球体和近曲小管细胞中的总RNA使用RNeasy@ Micro Kit（Qiagen, 德国杜塞尔多夫）提取。cDNA合成使用FastQuant RT Kit（含gDNase）（Tiangen Biotech; 中国北京）。qRT-PCR扩增在Line Gene 9620模型FQD-96A（Bioer）上进行，使用SYBR Green检测（Tiangen Biotech; 中国北京）。程序根据套件的生产商指导书及设备中包含的软件执行。数据分析使用软件版本2.0.6进行。mRNA水平的变化通过2-ΔΔCT方法确定。引物由Sangon Biotech（中国北京）购买。TBP和β-actin是肝球体和近曲小管屏障的内参基因。目标基因的引物序列在补充材料表1中显示。

统计分析：统计评估使用GraphPad Prism（版本6.0，美国加州圣地亚哥）和SPSS（版本17.0；IBM，美国纽约阿蒙克）进行。P值通过单向方差分析后，学生t检验计算得出。所有实验均进行了三次重复（对照组和低剂量组）或四次重复（高剂量和联合给药组）。除非另有说明，所有数据均以均值 ± 标准误差呈现。

Received: 18 November 2019; Accepted: 15 April 2020

Published: 1 June 2020
 

 

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